miR-32-5p靶向NFIL3基因促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)

李金秀 夏天 康壽磊

肺泡上皮細(xì)胞是肺臟結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，肺泡上皮細(xì)胞凋亡是急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的一個重要病理變化特征，ALI時肺組織嚴(yán)重破壞，呼吸功能嚴(yán)重受損[1]。炎性反應(yīng)在ALI的發(fā)生發(fā)展中有重要地位[2]。從分子生物學(xué)水平出發(fā)，在細(xì)胞層面通過探討特異性靶點(diǎn)可作為干預(yù)治療ALI的潛在手段，而研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA在肺損傷和修復(fù)過程中異常表達(dá)，并通過影響其靶基因的表達(dá)而調(diào)控炎性反應(yīng)，與ALI的進(jìn)展密切相關(guān)[3]。miR-32-5p參與結(jié)核分枝桿菌中的炎性反應(yīng)，其過表達(dá)減弱了炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)的積累[4]。核因子白介素-3(nuclear factor interleukin-3，NFIL3)是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄抑制因子，對于NK細(xì)胞和先天淋巴細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)NFIL3可通過靶向胰島素樣生長因子2受體抑制缺氧誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞死亡[7]。然而miR-32-5p和NFIL3對脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響及機(jī)制是否與miR-32-5p調(diào)控NFIL3相關(guān)還尚未可知，本文研究miR-32-5p是否通過調(diào)控NFIL3影響脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 肺上皮細(xì)胞A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、BCA試劑盒、PBS緩沖液購自美國Sigma公司；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液、PVDF膜、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組:將肺上皮細(xì)胞A549在37℃、含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每天換液1次，將融和至80%左右的細(xì)胞無血清饑餓培養(yǎng)12 h后進(jìn)行分組，用終濃度為30 μg/ml的LPS溶液刺激細(xì)胞作為LPS組，以未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為正常對照(NC)組。將miR-con、miR-32-5p、anti-miR-con、anti-miR-32-5p分別轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的A549細(xì)胞中，記為miR-con組、miR-32-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-32-5p組。將anti-miR-con、anti-miR-32-5p、pcDNA-con、pcDNA-NFIL3轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中再用30 μg/ml的LPS處理，記為LPS+anti-miR-con組、LPS+anti-miR-32-5p組、LPS+pcDNA-con組、LPS+pcDNA-NFIL3組。將anti-miR-32-5p與si-con、si-NFIL3分別共同轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中再用30 μg/ml的LPS處理，記為LPS+anti-miR-32-5p+si-con組、LPS+anti-miR-32-5p+si-NFIL3組；轉(zhuǎn)染均按照Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-32-5p和NFIL3 mRNA的表達(dá)水平:收集各組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；72℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3 Western blot檢測NFIL3、cleave-caspase-3蛋白表達(dá):收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個蛋白樣品重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強(qiáng)度。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA法檢測TNF-α和IL-6的表達(dá):取各組細(xì)胞，離心取上清，然后按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測miR-32-5p對NFIL3的靶向調(diào)控:TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示NFIL3 3′UTR區(qū)域有miR-32-5p結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含有miR-32-5p結(jié)合位點(diǎn)的NFIL33′UTR野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體(WT-NFIL3和MUT-NFIL3)，取對數(shù)生長期肺上皮細(xì)胞A549接種于24孔板(5×104個/孔)，待細(xì)胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM 2000將WT-NFIL3和MUT-NFIL3組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-con和miR-32-5p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞A549中miR-32-5p和NFIL3的表達(dá)水平 qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示，與NG組相比，LPS組A549細(xì)胞中miR-32-5p表達(dá)水平顯著升高，NFIL3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。可見，LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞A549中miR-32-5p高表達(dá)，NFIL3低表達(dá)。見表1，圖1。

圖1 NFIL3蛋白的表達(dá)

表1 miR-32-5p、NFIL3mRNA及NFIL3蛋白表達(dá)

2.2 miR-32-5p低表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng) 與NG組相比，LPS組A549細(xì)胞中miR-32-5p、cleave-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，TNF-α、IL-6含量顯著升高，細(xì)胞凋亡率也顯著升高(P<0.05)；與LPS+anti-miR-con組相比，LPS+anti-miR-32-5p組A549細(xì)胞中miR-32-5p、cleave-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，TNF-α、IL-6含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率也顯著降低(P<0.05)。可見，LPS可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)，而miR-32-5p低表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。見表2，圖2。

表2 miR-32-5p低表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)

圖2 miR-32-5p低表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)；A 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;B cleave-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.3 高表達(dá)NFIL3抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng) 與NG組相比，LPS組A549細(xì)胞中cleave-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，NFIL3表達(dá)水平顯著降低，TNF-α、IL-6含量顯著升高，細(xì)胞凋亡率也顯著升高(P<0.05)；與LPS+pcDNA-con組相比，LPS+pcDNA-NFIL3組A549細(xì)胞中cleave-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，NFIL3表達(dá)水平顯著升高，TNF-α、IL-6含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率也顯著降低(P<0.05)。可見，高表達(dá)NFIL3可抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。見表3，圖3。

圖3 Western Blot檢測cleave-caspase-3、NFIL3蛋白的表達(dá)

表3 高表達(dá)NFIL3抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)

2.4 miR-32-5p靶向NFIL3 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到NFIL3與miR-32-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NFIL3基因野生型和突變型表達(dá)載體后，相較于miR-con組，miR-32-5p組野生型肺上皮細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而突變型肺上皮細(xì)胞的熒光素酶活性差異不

顯著(P>0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示，相較于miR-con組，miR-32-5p組肺上皮細(xì)胞中NFIL3表達(dá)水平顯著降低；相較于anti-miR-con組，anti-miR-32-5p組肺上皮細(xì)胞中NFIL3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。可見，miR-32-5p可靶向調(diào)控NFIL3的表達(dá)。見表4、5，圖4。

圖4 miR-32-5p靶向調(diào)控NFIL3表達(dá)；A starbase對miR-32-5p和NFIL3結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖;B Western Blot檢測NFIL3表達(dá)量

表4 miR-con或miR-32-5p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5 敲減NFIL3可以部分逆轉(zhuǎn)anti-miR-32-5p對LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響 與LPS+anti-miR-con組相比，LPS+anti-miR-32-5p組A549細(xì)胞中NFIL3表達(dá)水平顯著升高，cleave-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，TNF-α、IL-6含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與LPS+anti-miR-32-5p+si-con組相比，LPS+anti-miR-32-5p+si-NFIL3組A549細(xì)胞中NFIL3表達(dá)水平顯著降低，cleave-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，TNF-α、IL-6含量顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)?？梢姡脺pNFIL3可以部分逆轉(zhuǎn)anti-miR-32-5p對LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的抑制作用。見表6，圖5。

表5 Western Blot檢測NFIL3的表達(dá)

表6 敲減NFIL3可以部分逆轉(zhuǎn)anti-miR-32-5p 對LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響

圖5 Western Blot檢測NFIL3、cleave-caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

ALI為常見且復(fù)雜的炎癥性肺疾病，ALI發(fā)病率和死亡率較高，主要的病理生理改變是彌漫性肺毛細(xì)血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障功能的破壞及炎癥損，減輕肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)可減緩ALI的進(jìn)展[8]。miRNA參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、脂肪代謝等生命過程[9]，且研究表明ALI發(fā)病過程中miRNA表達(dá)異常，miRNA可通過與靶mRNA部分結(jié)合在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，參與ALI的整個發(fā)病過程，miRNA在急性肺損傷中具有重要調(diào)節(jié)作用[10]。如脂多糖處理中miR-29b高表達(dá)，下調(diào)miR-29b可保護(hù)LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI，減輕炎性反應(yīng)[11]。miR-155反義寡核苷酸(ASO)可以降低IL-6和TNF-α水平，抑制炎性反應(yīng)，保護(hù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠ALI[12]。而miR-32-5p對ALI的影響還未見報道。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-32-5p促進(jìn)KLF4的表達(dá)增加了前列腺癌的化學(xué)敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。敲低miR-32-5p極大抑制了大鼠神經(jīng)性疼痛，并降低了炎性細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6蛋白的表達(dá)[14]。本實驗結(jié)果顯示，脂多糖處理促進(jìn)miR-32-5p的表達(dá)，miR-32-5p低表達(dá)抑制cleave-caspase-3的表達(dá)，抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡；且還降低IL-6、TNF-α的水平。與前人研究結(jié)果相似，說明miR-32-5p低表達(dá)可以減輕炎性反應(yīng)，促進(jìn)肺上皮細(xì)胞凋亡。

NFIL3是一種重要的負(fù)轉(zhuǎn)錄因子，它通過與IGF2R啟動子結(jié)合，抑制缺氧條件下H9c2心肌細(xì)胞中IGF2R信號通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。NFIL3過度表達(dá)通過抑制TRAIL和拮抗過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡來支持腫瘤細(xì)胞的存活[15]。抑制NFIL3消除了IL-5對地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[16]。以上結(jié)果表明，過表達(dá)NFIL3促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，脂多糖處理抑制NFIL3的表達(dá)，高表達(dá)NFIL3抑制cleave-caspase-3的表達(dá)，抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。此外，CIK細(xì)胞中超表達(dá)NFIL3能有效減少細(xì)菌入侵，并能抑制入侵后細(xì)胞的增殖；其與顯著激活NF-κB活性，提高干擾素IFN和白介素IL-10基因的表達(dá)有關(guān)[17]。而本研究中過表達(dá)NFIL3也降低了IL-6、TNF-α的水平。本實驗還發(fā)現(xiàn)miR-32-5p靶向調(diào)控NFIL3的表達(dá)，敲減NFIL3可以部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-32-5p對脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的抑制作用。提示，miR-32-5p可能通過調(diào)控NFIL3影響脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。

綜上所述，miR-32-5p可抑制脂多糖誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和減輕炎性反應(yīng)，其機(jī)制與上調(diào)NFIL3及抑制炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)有關(guān)。可為ALI的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。