老年重癥肺炎患者血清中活化蛋白C、髓樣分化因子88水平與不良預(yù)后的關(guān)系

唐先俊 姚欣

重癥肺炎是臨床常見的一種由呼吸道感染引發(fā)的嚴重疾病，其發(fā)病迅速，可伴有呼吸衰竭、低氧血癥、低血壓等癥狀，在老年人發(fā)病中病死率高、預(yù)后差，對老年患者生命安全構(gòu)成極大威脅[1]。活化蛋白C(activated protein C，APC)是胰島素樣絲氨酸蛋白酶家族成員，可調(diào)控化學趨化因子、炎性因子及細胞因子的釋放，在多種炎癥疾病中表達失調(diào)[2]。曹雪濤等[3]研究顯示外周血APC水平在經(jīng)烏司他丁治療的重癥肺炎嬰幼兒中明顯升高，可能參與并影響重癥肺炎的發(fā)展進程。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是Toll/IL-1R家族成員之一，廣泛存在于多種細胞和組織中，表達升高可促進炎性反應(yīng)[4]。MyD88在重癥肺炎支原體肺炎患兒血清中表達升高，其可能在重癥肺炎支原體肺炎中發(fā)揮重要作用[5]?；诖?，本研究通過觀察APC、MyD88在老年重癥肺炎患者血清中的水平，并分析兩者與不良預(yù)后的關(guān)系，以期為動態(tài)監(jiān)控并預(yù)后評估老年重癥肺炎提供臨床參考憑據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年4月至2018年10月我院收治的老年重癥肺炎患者60例為患病組，其中男32例，女28例；年齡65～80歲，平均年齡(72.47±6.27)歲。選擇同期健康體檢者57例為健康組，其中男29例，女28例；年齡66～79歲，平均年齡(72.28±6.11)歲。2組性別比、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方法符合倫理學規(guī)定，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 標準

1.2.1 重癥肺炎診斷標準：依照《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》中的相關(guān)判定標準[6]。

1.2.2 納入標準：①符合重癥肺炎診斷標準者；②患者年齡均≥65歲；③生理病理資料完整者；④所有患者或者其家屬簽署知情同意書。

1.2.3 排除標準：①入院時即發(fā)生急性心力衰竭、嚴重的肝腎功能不全、慢阻肺者；②合并自身免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤者；③合并血小板降低、嚴重凝血功能障礙、活動性出血、顱內(nèi)出血者；④近期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗凝藥者。

1.3 評分標準與預(yù)后情況 (1)急性生理學和慢性健康狀況Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)評分標準[7]：常作為判斷重癥加強治療病房(intensive care unit，ICU)患者病情及預(yù)后評估的指標，評分范圍0～71分。包含急性生理學評分(APS)、慢性健康評分、年齡評分三部分，最終評分是以上三項評分總和，以APACHEⅡ>15分表示重癥，其分值越高，患者病情越嚴重。(2)預(yù)后情況：對60例老年重癥肺炎患者進行28 d隨訪，以患者出院病情轉(zhuǎn)歸或轉(zhuǎn)出ICU情況為存活組(39例)、死亡組(21例)。

1.4 主要試劑 TRIzol RNA提取試劑(貨號：5007050)購買于上海酶研生物科技有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號：WE0132-EOK)購買于北京百奧萊博科技有限公司，SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(貨號：HY-K0501)購買于美國Med Chem Express LLC公司；人APC酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)試劑盒(貨號：CSB-E09909h-1)購買于上海振譽生物科技有限公司，人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號：QN-PS0122)購買于上海喬羽生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 標本采集及預(yù)處理:收集患病組確診當天、健康體檢者當日清晨空腹外周血約4 ml，室溫下靜置約35 min，于4℃以12 000 g離心12 min，收集上層血清，分裝于1.5 ml凍存管中，于-80℃環(huán)境中保存，待測。

1.5.2 ELISA法檢測血清APC、TNF-α水平:美國Thermo K3(30000)全自動多功能酶標儀檢測2組受試者血清APC、TNF-α水平，具體檢測步驟參照相關(guān)試劑盒說明書。

1.5.3 實時熒光定量法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測2組血清MyD88水平:取出保存于-80℃環(huán)境中的血清樣本，冰上解凍，加適量TRIzol裂解樣本，此次加氯仿、異丙醇、70%乙醇提取樣本的總RNA，以0.1% DEPC溶解總RNA，作為逆轉(zhuǎn)錄的模板。依照qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA第一鏈合成試劑盒操作步驟及注意事項配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR擴增檢測采用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系配制按照其說明書進行。待測MyD88及內(nèi)參分別設(shè)置3個復(fù)孔進行半定量檢測。MyD88以β-actin為內(nèi)參，其對應(yīng)引物序列見表1，其相對表達量以2-ΔΔCT計算。見表1。

表1 MyD88及內(nèi)參β-actin引物序列

2 結(jié)果

2.1 2組血清APC、MyD88、TNF-α水平和APACHEⅡ評分情況 與健康組比較，患病組患者血清APC水平明顯降低(P<0.05)，血清MyD88、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?；疾〗M患者的APACHEⅡ評分為(22.12±3.77)分。見表2。

表2 2組血清APC、MyD88、TNF-α水平和APACHEⅡ評分比較

2.2 2組不同預(yù)后老年重癥肺炎患者血清APC、MyD88水平和APACHEⅡ評分比較 與存活組比較，死亡組患者血清APC水平明顯降低(P<0.05)，血清MyD88、TNF-α水平、APACHEⅡ評分明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組不同預(yù)后老年重癥肺炎患者相關(guān)指標比較

2.3 老年重癥肺炎患者血清APC、MyD88水平與TNF-α、APACHEⅡ評分的關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，老年重癥肺炎患者血清APC與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈負相關(guān)(r=-0.412、-0.458，P<0.05)，MyD88與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈正相關(guān)(r=0.356、0.525，P<0.05)。見表4。

表4 老年重癥肺炎患者血清APC、MyD88水平與TNF-α、APACHEⅡ評分的關(guān)系

2.4 Logistic回歸分析老年重癥肺炎預(yù)后的影響因素 以老年重癥肺炎預(yù)后為因變量，以血清TNF-α、APACHEⅡ評分、APC、MyD88為自變量，行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示TNF-α、APACHEⅡ評分、MyD88為老年重癥肺炎預(yù)后的危險因素(P<0.05)，APC為老年重癥肺炎預(yù)后的保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響老年重癥肺炎預(yù)后的Logistic回歸分析

2.5 血清APC、MyD88對老年重癥肺炎患者預(yù)后的診斷價值 ROC曲線顯示，血清APC水平預(yù)測老年重癥肺炎患者不良預(yù)后的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.873(95%CI:0.786,0.960)，截斷值為28.65 pmol/L，此時其靈敏度、特異度分別為85.7%、71.8%；血清MyD88水平預(yù)測老年重癥肺炎患者不良預(yù)后的AUC為0.781(95%CI:0.683,0.910)，截斷值為1.98 pmol/L，此時其靈敏度、特異度分別為71.4%、84.6%；血清APC、MyD88水平預(yù)測老年重癥肺炎患者不良預(yù)后的AUC為0.918(95%CI:0.840,0.997)，其靈敏度、特異度分別為94.2%、80.5%。見圖1。

圖1 血清APC、MyD88對老年重癥肺炎患者不良預(yù)后的ROC評價

3 討論

重癥肺炎多是感染特殊病原微生物引起肺部損傷的危重癥疾病，其發(fā)生時伴有大量炎性因子入血、電解質(zhì)紊亂、腦水腫、膿毒癥等并發(fā)癥，病情危重且預(yù)后較差，尤其老年人[8]。因此，尋找合理評估重癥肺炎預(yù)后指標對患者病情準確評估和改善患者預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。

APC是由各種因素刺激蛋白C形成12個氨基酸構(gòu)成的活性多肽，在胞內(nèi)信號傳遞、抗凝、抗凋亡、活化內(nèi)皮細胞屏障等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[9]。APC在類風濕性關(guān)節(jié)炎疾病中表達失調(diào)，其可能在類風濕性關(guān)節(jié)炎炎癥過程中發(fā)揮作用[10]。APC在脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷中異常表達，其可調(diào)節(jié)TNF-α、白介素-6等炎性細胞因子，進而影響肺部炎癥程度[11]。以上研究表明APC在炎癥類疾病過程中表達異常。本研究顯示，患病組老年重癥肺炎患者血清APC水平明顯低于健康組，提示APC在老年重癥肺炎疾病進展中起到一定作用。MyD88廣泛分布于肝、脾、腎、肌肉等組織及免疫細胞中，是重要信號傳導(dǎo)分子，可影響機體防御蛋白及細胞因子的轉(zhuǎn)錄及表達，從而調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)[12]。MyD88在經(jīng)通絡(luò)開痹片輔助治療的類風濕關(guān)節(jié)炎患者中表達下調(diào)，其可能在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮一定作用[13]。MyD88在Cm呼吸道感染的肺組織中高表達，其可能影響炎性反應(yīng)進程[14]。本研究中血清MyD88水平明顯高于健康組，提示MyD88可能影響老年重癥肺炎的發(fā)生與發(fā)展。

TNF-α在重癥肺炎患者血漿中的水平明顯升高，其可作為診治重癥肺炎的輔助指標[15]。APACHEⅡ評分廣泛應(yīng)用于危重疾病患者的病情嚴重程度及預(yù)后情況評估，是老年重癥肺炎的預(yù)后影響因素[16]。本研究中老年重癥肺炎患者血清TNF-α水平、APACHEⅡ評分明顯高于健康組，提示老年重癥肺炎與細胞炎性因子、APACHEⅡ評分密切相關(guān)。本研究中死亡組老年重癥肺炎患者血清APC水平明顯低于存活組，血清MyD88、TNF-α水平、APACHEⅡ評分明顯明顯高于存活組，提示監(jiān)測血清APC、MyD88、TNF-α水平及APACHEⅡ評分，對評估老年重癥患者預(yù)后有一定的參考價值。

本研究中老年重癥肺炎患者血清APC與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈負相關(guān)，MyD88與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈正相關(guān)，提示APC、MyD88可能與TNF-α、APACHEⅡ相互影響，從而共同作用于老年重癥肺炎的發(fā)病進程。進一步研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、APACHEⅡ評分、MyD88為老年重癥肺炎預(yù)后的危險因素，APC為老年重癥肺炎預(yù)后的保護因素，提示升高TNF-α、APACHEⅡ評分、MyD88水平，降低APC水平，均會增加老年重癥肺炎患病幾率，對TNF-α、APC、MyD88水平及時監(jiān)測，并對患者進行APACHEⅡ評分，有助于及早判定并控制老年重癥肺炎的病情進展。血清APC、MyD88水平對老年重癥肺炎患者預(yù)后的預(yù)測AUC分別為0.873、0.781，當血清APC含量低于28.65 pmol/L或MyD88表達水平高于1.98，老年重癥肺炎不良預(yù)后幾率較高，提示血清APC、MyD88對老年重癥肺炎預(yù)后有一定診斷價值，血清APC、MyD88聯(lián)合診斷老年重癥肺炎不良預(yù)后的AUC為0.918，其靈敏度94.2%，特異度為80.5%，提示APC、MyD88聯(lián)合診斷老年重癥肺炎不良預(yù)后的價值高于單獨診斷，兩者聯(lián)合可提高老年重癥肺炎不良預(yù)后的診斷效能。

綜上所述，老年重癥肺炎患者血清APC水平降低，MyD88表達上調(diào)，APC和MyD88可能參與老年重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展過程，APC和MyD88聯(lián)合可提高老年重癥肺炎預(yù)后的診斷價值，具有一定參考價值。