miRNA-133b在卵巢癌組織中的表達(dá)及對MMP-9的影響

王愛芹 左衛(wèi)微 翟文欣

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其死亡率位居婦科惡性腫瘤首位[1]。由于卵巢癌發(fā)病隱匿，早期無典型癥狀，超過70%患者初治即為晚期，發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。初始腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及術(shù)后聯(lián)合鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療是晚期卵巢癌的主要治療模式，雖然大多數(shù)卵巢癌患者對鉑類化療藥物初始反應(yīng)有較好的應(yīng)答，但70%患者2年內(nèi)復(fù)發(fā)并逐漸發(fā)展為鉑類耐藥。近年來發(fā)展的分子靶向藥物如貝伐單抗、PARP抑(奧拉帕利、尼拉帕利)等聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療或傳統(tǒng)的細(xì)胞毒化療能夠有效的延長患者的生存，然而目前晚期卵巢癌患者5年生存率仍僅為30%～40%[2]。晚期診斷和鉑類耐藥是導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后不良的主要原因[3]。因此，尋找用于卵巢癌早期診斷及對其侵襲和轉(zhuǎn)移有預(yù)測價值的生物學(xué)指標(biāo)具有重要的臨床意義。基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)屬于鋅肽酶超級家族成員，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的Ⅳ、Ⅴ型膠原及明膠，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示卵巢癌組織中MMP-9表達(dá)水平顯著高于正常組織，且其表達(dá)水平與卵巢癌分期相關(guān)[4,5]。然而其表達(dá)異常的調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。微小RNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈RNA，片段長度僅有19～25個核苷酸，在調(diào)控基因表達(dá)方面起重要作用。miRNA可通過與靶基因信使RNA的3’非編碼區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)互補(bǔ)性結(jié)合來負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miRNA-133b可靶向調(diào)控MMP-9基因mRNA的表達(dá)。本研究檢測miRNA-133b在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)情況，并分析其與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性及miRNA-133b的表達(dá)水平對卵巢癌的輔助診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年3月至2019年10月于我院婦科住院行手術(shù)治療卵巢癌患者52例(病例組)?；颊呔心[瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)前均未接受新輔助化療，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為卵巢癌?；颊吣挲g28～73歲，平均年齡(53.8±9.5)歲。腫瘤組織學(xué)類型：漿液性腺癌36例、子宮內(nèi)膜樣癌10例、粘液性腺癌6例；腫瘤分化程度：高中分化28例、低分化24例；FIGO分期：Ⅰ期11例、Ⅱ期7例、Ⅲ期28例、Ⅳ期6例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性36例。于同期隨機(jī)選取55例因子宮肌瘤或?qū)m頸癌行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織為對照組，其中子宮肌瘤患者31例，宮頸癌患者24例，術(shù)中證實(shí)無卵巢腫瘤，術(shù)后病理診斷為正常卵巢。對照組患者年齡40～72歲，平均年齡(54.3±7.9)歲；2組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大體標(biāo)本離體后迅速收集，放于裝有RNAlater液的凍存管里并浸泡，4℃過夜后轉(zhuǎn)置-20℃低溫保存?zhèn)溆?。?biāo)本和資料收集均由患者本人知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol試劑(北京索萊寶生物有限公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；Go Taq Green Master Mix(美國Qiagen公司)；miRNA 提取試劑盒(美國Qiagen公司)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Qiagen公司)；miScript SYBR Green PCR Kit(美國Qiagen公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 提取總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：應(yīng)用TRIzol試劑按照說明書操作抽提卵巢癌組織及正常卵巢組織總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000檢測總RNA的純度和濃度，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?yīng)用miRNA提取試劑盒抽提上述組織的miRNA，檢測其純度和濃度后，應(yīng)用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 miRNA-133b及MMP-9基因mRNA的檢測:目的基因MMP-9的mRNA檢測應(yīng)用Go Taq Green Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 模板1.0 μl、上游引物各 1.4 μl、Rox 0.1 μl、Green Master Mix 1.0 μl、最后加去離子水至20 μl；反應(yīng)條件設(shè)定：95℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)(95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s)，最后95℃變性15 s、60℃退火60 s、95℃延伸30 s。反應(yīng)引物序列：目的基因MMP-9上游引物序列5’- GGG ACG CAG ACA TCG TCA TC-3’，下游引物序列5’- TCG TCA TCG TCG AAA TGG GC-3’； 以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，GAPDH基因上游引物序列5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物序列5’- TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。目的基因miRNA-133b應(yīng)用miScript SYBR Green PCR Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 模板1.0 μl、上游引物各 1.0 μl、Ultra SYBR Mix 5.0 μl、最后加去離子水至10 μl；反應(yīng)條件設(shè)定：95℃預(yù)變性15 min，然后40個循環(huán)(94℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s)。目的基因miRNA-133b上游引物5’- GCG GTT TGG UCC CCT TCA AC -3’，下游引物5’- GTG CAG GGT CCG AGG T-3’；以U6基因內(nèi)參，U6基因上游引物序列5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物序列5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。根據(jù)系統(tǒng)生成的Ct值，采用2-△△CT法進(jìn)行計算，獲得MMP-9基因mRNA和miRNA-133b在各樣本中的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9和miRNA-133b在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)情況 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示MMP-9基因mRNA在卵巢癌組織中的相對表達(dá)量為(1.98±0.64)，在正常卵巢組織中的相對表達(dá)量為(1.02±0.41)，卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA的表達(dá)量顯著高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.239，P<0.001)。卵巢癌組織中miRNA-133b的相對表達(dá)量為(0.94±0.41)，正常卵巢組織中miRNA-133b的相對表達(dá)量為(2.05±0.63)，2組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-10.648，P<0.001)。見圖1。

圖1 擴(kuò)增曲線；A：MMP-9基因擴(kuò)增曲線；B：miRNA-133b基因擴(kuò)增曲線

2.2 卵巢癌組織中MMP-9和miRNA-133b表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA的表達(dá)水平與miRNA-133b表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.433，P=0.001)，表明在卵巢癌組織中miRNA-133b可能靶向調(diào)控MMP-9的表達(dá)。見圖2。

圖2 卵巢癌組織中miRNA-133b與MMP-9 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.3 MMP-9基因mRNA表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA的相對表達(dá)量與卵巢癌患者的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、組織學(xué)分級、腫瘤病理類型、手術(shù)殘余病灶大小無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 MMP-9 基因mRNA表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 miRNA-133b表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 卵巢癌組織中miRNA-133b的相對表達(dá)量與卵巢癌患者FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、組織學(xué)分級、腫瘤病理類型、手術(shù)殘余病灶大小無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 卵巢癌組織中miRNA-133b表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 卵巢癌組織中miRNA-133b表達(dá)對卵巢癌的診斷意義 受試者工作特征曲線分析結(jié)果提示miRNA-133b診斷卵巢癌的ROC曲線下面積(AUC值)為0.927，95%可信區(qū)間為0.881～0.975，與AUC=0.5比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，說明卵巢癌組織中miRNA-133b表達(dá)對卵巢癌的診斷具有較高的準(zhǔn)確性。最優(yōu)截斷點(diǎn)(cut-off值)為1.638，在最優(yōu)截斷點(diǎn)靈敏度和特異度分別為76.4%和94.2%；漏診率和誤診率分別為23.6%和5.8%。見圖3。

圖3 卵巢癌組織中miRNA-133b表達(dá)水平判斷卵巢癌的ROC曲線

3 討論

卵巢癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌而列居第三位，死亡率卻位居婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌具有極強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，這造成其高的致死率。因此，尋找有效抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)是臨床治療卵巢癌的關(guān)鍵所在。本研究分析與腫瘤侵襲相關(guān)的MMP-9基因mRNA及可能調(diào)控其表達(dá)的miRNA-133b在卵巢癌與正常卵巢組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA表達(dá)顯著升高，miRNA-133b表達(dá)顯著下調(diào)，且兩者的表達(dá)量在卵巢癌組織中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；通過ROC曲線分析，卵巢癌組織中miRNA-133b的表達(dá)水平對卵巢癌診斷具有較高的準(zhǔn)確性。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個主動、復(fù)雜、多步驟的過程，包括腫瘤細(xì)胞黏附、降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)，使其突破自身基底膜在間質(zhì)中形成浸潤灶，再以同樣的方式穿破進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類鋅依賴性的內(nèi)肽酶家族，其在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中是必不可少的。MMPs幾乎能降解基底膜所有成分，從而參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成[6]。MMP-9是MMPs家族重要成員之一。MMP-9可降解和破壞基底膜中的主要成分Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。Huang等[7]研究發(fā)現(xiàn),將人卵巢癌細(xì)胞種植于MMP-9基因缺失型和MMP-9基因野生型裸鼠腹腔內(nèi)，MMP-9基因缺失組在腫瘤的成瘤率、生長速度、微血管密度等方面顯著低于MMP-9基因野生型組,表明MMP-9在卵巢癌的生長和浸潤過程中發(fā)揮重要作用。Sakata等[8]報道了MMP-9在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于正常卵巢組織，且其表達(dá)水平隨腫瘤分級的增加而增高。此外，Ozalp等[9]研究表明，表達(dá)MMP-9蛋白低的上皮性卵巢癌患者生存時間明顯長于MMP-9表達(dá)蛋白高的卵巢癌患者。

本研究結(jié)果與上述報道結(jié)果一致,卵巢癌組織中 MMP-9基因mRNA表達(dá)水平顯著高于正常卵巢組織，提示MMP-9表達(dá)升高可能在卵巢組織的癌變過程中發(fā)揮作用。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的卵巢癌患者M(jìn)MP-9表達(dá)水平明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者，說明 MMP-9表達(dá)可能與卵巢癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的潛能密切相關(guān)。臨床分期是判斷卵巢癌患者預(yù)后最重要的因素,本研究中Ⅲ、Ⅳ期患者的 MMP-9基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者,說明MMP-9表達(dá)水平有可能作為判斷卵巢癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

miRNA是一類長度約18～25個核苷酸非編碼小分子單鏈RNA，作為重要的基因調(diào)控分子，其在調(diào)控組織特異性基因表達(dá)方面起重要作用。miRNAs以堿基配對的方式與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合，誘導(dǎo)沉默復(fù)合物形成來抑制靶mRNA的翻譯，從而負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中存在多種miRNAs的差異表達(dá)，這些表達(dá)異常的miRNAs通過調(diào)控靶基因的表達(dá)在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[10]。先前的文獻(xiàn)報道了miRNA-133b與MMP-9基因存在靶向關(guān)系，低表達(dá)的miRNA-133b通過上調(diào)MMP-9的表達(dá)，在腎癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[11]。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)的miRNA-133b通過靶向調(diào)控MMP-9的表達(dá)來促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成。生物信息學(xué)在線軟件(targetscan和miRanda)分析也證實(shí)miRNA-133b與MMP-9基因存在靶向關(guān)系，故我們選取miRNA-133b來檢測其在卵巢癌組織中的表達(dá)，并分析其在卵巢癌組織中是否與MMP-9基因存在靶向關(guān)系。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示卵巢癌組織中miRNA-133b的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織，且臨床病理參數(shù)分析顯示miRNA-133b的表達(dá)水平與卵巢癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析顯示卵巢癌組織中miRNA-133b的表達(dá)量與MMP-9基因 mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)性。這些結(jié)果表明表達(dá)下調(diào)的miRNA-133b可能通過上調(diào)MMP-9的表達(dá)來增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。雖然我們的結(jié)果及先前的研究報道表明miRNA-133b可能是一種抑癌因子，通過抑制MMP-9的表達(dá)來抑制腎癌、大腸癌、卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。但是也有報道稱miRNA-133b可以通過調(diào)控SF3B4的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，在肝癌的發(fā)生中起促癌作用[13]。因此，需要系統(tǒng)的、深入的研究來明確miRNA-133b在不同腫瘤類型中功能及作用機(jī)制。

本研究中，我們采用ROC曲線分析了卵巢癌組織中miRNA-133b表達(dá)水平對卵巢癌的診斷價值，結(jié)果顯示miRNA-133b對卵巢癌的診斷具有較高的準(zhǔn)確性，可以作為卵巢癌的一個診斷預(yù)測指標(biāo)。經(jīng)過分析最優(yōu)截斷點(diǎn)(cut-off值)為1.638，其靈敏度和特異度分別為76.4%和94.2%；漏診率和誤診率分別為23.6%和5.8%。在這一cut-off值下所作出的診斷漏診率非常低。考慮到癌組織的不易獲得性，在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步研究卵巢癌患者外周血中miRNA-133b的表達(dá)情況，明確外周血中miRNA-133b表達(dá)水平對于卵巢癌診斷的價值。此外，我們還將應(yīng)用熒光素酶報告基因載體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-133b與MMP-9的靶向關(guān)系。在卵巢癌細(xì)胞珠中，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)改變miRNA-133b的表達(dá)后，觀察卵巢癌細(xì)胞珠增殖、侵襲能力的改變情況，從而明確miRNA-133b對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

綜上所述，卵巢癌組織中miRNA-133b表達(dá)降低可能通過靶向上調(diào)MMP-9基因來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，從而在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中起作用。因此，進(jìn)一步探索其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，可為卵巢癌的早期診斷、預(yù)防及治療提供新思路。