miRNA-183-5p在乳腺癌患者的表達(dá)及對(duì)乳腺細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲的影響

汪正燕 黃云輝 楊磊 劉瑩

乳腺癌是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的惡性腫瘤。乳腺癌作為一種惡性腫瘤，對(duì)女性的身心健康構(gòu)成巨大威脅[1]。其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前仍然不能確切弄清楚其發(fā)病原因。其早期難以覺(jué)察，出現(xiàn)典型癥狀后則進(jìn)入晚期，且尚無(wú)有效治療方法應(yīng)對(duì)晚期乳腺癌。因此，弄清楚乳腺癌的致病機(jī)制，或者找到其早期的檢測(cè)標(biāo)記物尤為重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的非編碼小分子RNA。它們可抑制靶基因翻譯，進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)的生理過(guò)程都需要miRNA的參與，其中也包括多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程[2]。有研究表明，許多種miRNA都參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可有望作為乳腺癌的檢測(cè)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，其中miRNA-183在抑制食管鱗狀細(xì)胞癌[3,4]、肝癌[5]、直腸癌[6]以及黑色素瘤[7]等多種腫瘤方面發(fā)揮重要作用。另外，周旋等[8]基于生物信息學(xué)對(duì)乳腺癌miRNA生物標(biāo)志物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了miRNA-141等6個(gè)上調(diào)基因，以及miRNA-183等8個(gè)下調(diào)基因。但是miRNA-183-5p對(duì)于乳腺癌分發(fā)展中有何作用還未得到曾證實(shí)。為此，本研究檢測(cè)乳腺癌組織中miRNA-183-5p的水平，并分析其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2019年5月于我院確診的93例晚期女性乳腺癌患者為研究對(duì)象，年齡45～64歲，平均年齡(53.83±1.92)歲；體重48～61 kg，平均(53.03±4.27) kg?；颊呔鶡o(wú)其他嚴(yán)重并發(fā)癥。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情并簽署同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者符合《腫瘤學(xué)》[9]中乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且術(shù)后經(jīng)病理組織學(xué)確診。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：接受過(guò)化療的患者；同時(shí)患有其他惡性腫瘤患者；影像學(xué)資料、病歷資料等不完整的患者。

1.3 Real-time PCR檢測(cè) 根據(jù)GeneBank中miRNA-183的序列(NR_029615.1)，設(shè)計(jì)反向引物(5’-CTCA

ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAATTC

ACT-3’)；和Real-Time PCR引物對(duì)(F:5’-ACACTCC

AGCTGGGCATCTTCCAGAGTGAA-3’,R:5’-TGGTGT

CGTGGAGTCG-3’)以及內(nèi)參基因U6引物對(duì)(F：5’-G

CTTCGGCAGCACATATACTAAAAAT-3’,R：5’-CGCTT

CACGAATTTGCGTGTCAT-3’)，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將所有患者的乳腺癌組織和癌旁組織中取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織各1塊。提取所有樣本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix(AT401-01)試劑盒，結(jié)合上述反向引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。將上述cDNA作為模板，使用全式金公司的TransStart Top Green qPCR SuperMix (+Dye II) (AQ132-24)在快速型實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI7500)上對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。

1.4 Minics轉(zhuǎn)染及檢測(cè) 針對(duì)miRNA-141-5p的序列(UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成mimics (F:5’-UAUGGCAC

UGGUAGAAUUCACU-3’,R:5’-AGUGAAUUCUACCAG

UGCCAUA-3’)及對(duì)照(F:5’-AGAAUUCACUUAUGGC

ACUGGU-3’,R:5’-CAGUGCCAUAAGUGAAUUCUAC-

3’)。將MDA-MB-231細(xì)胞分為3組，其中轉(zhuǎn)染miRNA-183-5p mimics的為mimics組；轉(zhuǎn)染陰性mimics的為control mimics組；不做處理的為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用Real-time PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞中的miRNA-141-5p的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot 檢測(cè) 將MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞，分別加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以3.0×105個(gè)/孔的密度接種12孔板，3組細(xì)胞經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印槽 (Trans-Blot SD,170-3940) 在恒壓15 V，30 min條件下轉(zhuǎn)印至PVDV膜(生工，F(xiàn)019532-0010)。取下PVDF膜放入封閉液(TBST，5%脫脂奶粉，pH值7.4)中室溫孵育2 h；使用一抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，10 min/次；使用全式金公司生產(chǎn)的HRP標(biāo)記的二抗羊抗鼠IgG 稀釋液(HS201-01,1∶10 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，10 min/次；最后根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光液(上海天能)使用說(shuō)明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)中所用到的一抗有E-cadherin抗體(GeneTex,GTX100443)，Vimentin抗體(GeneTex,GTX112661)以及MMP-9抗體(santacruze,sc-393859)，檢測(cè)3組細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，并計(jì)算F值和P值。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 按上述方法制作3組MDA-MB-231細(xì)胞，接種到6孔板中(6×105)。24 h后，用20 μl槍頭垂直于孔底劃痕。用PBS清洗3次，換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0 h沿劃痕邊緣等間距取3處測(cè)量劃痕寬度的平均值，48 h 后在相同位置測(cè)量寬度。按照下列公式計(jì)算愈合率：愈合率(%)=(0 h寬度-48 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn) MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-183-5p mimics后，消化細(xì)胞于無(wú)血清培養(yǎng)基。將2.5×104個(gè)細(xì)胞加入鋪有基質(zhì)膠的24孔Transwell小室的上室，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后取出Transwell小室，用棉簽擦掉基質(zhì)膠及上室未穿膜細(xì)胞。甲醇固定10 min，0.2%結(jié)晶紫染色40 min，100倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目，取平均值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-141-5p在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平比較 miRNA-183-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miRNA-183-5p在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平比較

2.2 miRNA-141-5p在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和正常乳腺細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)水平比較 miRNA-183-5p在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于MCF-10A細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miRNA-183-5p在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和正常乳腺細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)水平比較

2.3 miRNA-183-5p mimics轉(zhuǎn)染效率比較 與對(duì)照組細(xì)胞比較，mimics control組細(xì)胞中miRNA-183-5p表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；mimics組細(xì)胞中miRNA-183-5p表達(dá)量較其他2組顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miRNA-183-5p在3組細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.4 miRNA-183-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 MMP-9、E-cadherin和Vimentin在3組細(xì)胞中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，3種蛋白的表達(dá)量在對(duì)照組和mimics control組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；mimics組中E-cadherin的表達(dá)量顯著高于其他2組(P<0.05)；mimics組中MMP-9和Vimentin的表達(dá)量顯著低于其他2組(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖1。

表4 miRNA-183-5p高表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

圖1 miRNA-183-5p高表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

2.5 miRNA-183-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響 3組細(xì)胞的愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，對(duì)照組和mimics control組細(xì)胞的愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；mimics組細(xì)胞的愈合率顯著低于其他2組(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖2。

表5 miRNA-183-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

圖2 miRNA-183-5p高表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

2.6 miRNA-183-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響 3組細(xì)胞的計(jì)數(shù)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，對(duì)照組和mimics control組中細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；mimics組中細(xì)胞數(shù)量顯著低于其他2組(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖3。

表6 miRNA-183-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響 n=5,個(gè),

圖3 miRNA-183-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

乳腺癌是一種發(fā)病率極高的乳腺上皮組織的惡性腫瘤，且病死率較高[10,11]。乳腺癌因早期癥狀不明顯而不易被發(fā)覺(jué)，使得患者不能得到及時(shí)治療而發(fā)展到晚期。對(duì)于晚期乳腺癌的治療，只能采取全切除的治療方法，雖然能夠較有效地抑制腫瘤惡化，但是預(yù)后并不理想[12]。因此，為提高乳腺癌的早期診斷和晚期的治療，迫切需要找到新的診斷方法和治療靶點(diǎn)。

miRNA是一類存在于真核生物體內(nèi)的非編碼RNA，參與體內(nèi)多種生理反應(yīng)[13]。有研究表明，多種miRNA都與乳腺癌有密切的聯(lián)系[14-16]。其中，miRNA-183家族成員在多種腫瘤中的異常表達(dá)預(yù)示著其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中充當(dāng)重要作用[17]，但miRNA-183在乳腺癌中的具體作用機(jī)制認(rèn)不清楚。有研究證實(shí)，miRNA-96-182-183等miRNA-183家族成員可受生長(zhǎng)激素刺激，增加乳腺癌細(xì)胞侵襲力[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-183-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁組織組織。為探究miRNA-183-5p的異常表達(dá)對(duì)于乳腺癌的具體作用機(jī)制，我們?cè)谌橄侔┘?xì)胞MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染miRNA-183-5p mimics，使其在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，檢測(cè)該變化是否能夠影響MDA-MB-231細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲。

在MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染人工合成的miRNA-183-5p模擬物后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miRNA-183-5p表達(dá)明顯升高，達(dá)到預(yù)期效果。

上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是各種癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲等的重要原因之一，且存在于癌細(xì)胞發(fā)展的各個(gè)階段[19]。E-cadherin表達(dá)減少，Vimentin表達(dá)增多是其主要標(biāo)志[20]。本實(shí)驗(yàn)中，miRNA-183-5p表達(dá)量增高可顯著增加E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)降低Vimentin的表達(dá)。有效抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的EMT。

研究表明，MMP-9的異常高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的發(fā)展密切相關(guān)[21]。miRNA-183在抑制人黑色素瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中靶向作用于MMP-9[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA-183-5p表達(dá)量增高抑制了MMP-9的表達(dá)，預(yù)示miRNA-183-5p可能靶向作用于MMP-9，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT。

此外，細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，表明提高miRNA-183-5p表達(dá)量可以抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲。

綜上所述，miRNA-183-5p在乳腺癌組織和乳腺細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)。miRNA-183-5p高表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞EMT、遷移和侵襲，因此可考慮將miRNA-183-5p作為乳腺癌早期診斷的新指標(biāo)或治療的新靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)尚有不足之處：(1)樣本量不多，且沒(méi)有對(duì)入選患者進(jìn)行癌癥分期統(tǒng)計(jì)，不能較詳細(xì)的反應(yīng)臨床狀況，今后的研究中需要采集更多的樣本數(shù)量且統(tǒng)計(jì)更詳細(xì)的臨床資料。(2)本次實(shí)驗(yàn)人為的提高細(xì)胞中miRNA-183-5p的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上初步驗(yàn)證了miRNA-183-5p的作用，但是無(wú)法代表體內(nèi)的真實(shí)情況，仍需設(shè)法模擬真實(shí)狀況；(3)本文缺乏相關(guān)信號(hào)通路的探索，今后需要集中在該方面的研究，以完善乳腺癌的發(fā)病機(jī)制。