羥考酮對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的影響

文放放 李熊剛

肝癌是指來源于肝細胞和肝膽管細胞的惡性腫瘤，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，在我國高發(fā)且危害極大的一種臨床常見惡性腫瘤，早期肝癌癥狀常無特異性，中晚期肝癌的癥狀則較多，我國肝癌病死率占全球肝癌病死率的50%，占我國腫瘤致死性疾病第二位[1,2]。肝癌早期缺乏典型癥狀，診斷率低，患者一經(jīng)確診多已進入終末期，失去手術治療指征，肝癌終末期極易擴散，很難治愈，病死率高[3]。因此尋找具有抗癌活性的藥物成為近來臨床研究熱點。羥考酮(Oxycodone)是從蒂巴因中自然衍生的半合成物，屬于一種強阿片類鎮(zhèn)痛藥物，臨床常用來治療癌癥和慢性非癌癥性疼痛[4]。研究報道，羥考酮預先給藥可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路、JAK2/STAT3通路等減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡[5,6]。PI3K/Akt通路是一種重要凋亡抑制通路，通過對靶蛋白磷酸化發(fā)揮抗凋亡作用，可促進肝癌細胞生長、增殖、黏附能力及黏附分子表達[7,8]。然而關于羥考酮對肝癌HepG2細胞生物活性的影響筆者所見鮮有研究，因此本研究探討不同濃度羥考酮對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡及對PI3K/Akt通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器 HepG2細胞來源于中國醫(yī)學科學院，由本科室體外培養(yǎng)凍存?zhèn)溆茫畸}酸羥考酮注射液(Oxycodone)均購自美國Gibco；MTT試劑盒(貨號：11465007001)、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(貨號：APOAF)購自美國Sigma。鼠源一抗β-actin抗體(貨號：MA5-15739)、Bcl-2(貨號：13-8800)、Bax(貨號：MA5-13994)、PTEN(貨號：MA5-12278)、AKT(貨號：AHO1112)、兔源cleaved-Caspase3(貨號：700182)、p-AKT(貨號：MA5-14916)抗體、PI3K(貨號：PA5-32550)，p-PI3K(貨號：MA5-14870)二抗羊抗鼠IgG(貨號：A-11001)羊抗兔IgG(貨號：A-11008)均購自美國Invitrogen；CO2培養(yǎng)箱(美國，Thermo Fisher)、熒光顯微鏡(日本，奧林巴斯)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):配制含有10%FBS、1%青鏈霉素RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，將肝癌HepG2細胞復蘇后置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞傳代時用0.25%胰蛋白酶消化。

1.2.2 MTT法檢測肝癌HepG2細胞增殖:將對數(shù)期肝癌HepG2細胞接種于96孔細胞板，接種密度約0.5×105個/孔，每孔添加培養(yǎng)液200 L。細胞完全貼壁后更換培養(yǎng)基并添加終濃度為1、10、20、40、80 μg/ml 羥考酮處理(Oxycodone treatment)，對應分別設為OT-1組、OT-10組、OT-20組、OT-40組、OT-80組，另設無任何添加空白肝癌HepG2細胞為對照組(NC組)，每組6個重復，分別培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結束后用MTT試劑盒檢測各孔細胞增殖情況，具體操作嚴格按照說明書進行。細胞增殖抑制率=(1-ODOT組/ODNC組)×100%。

1.2.3 平板克隆試驗檢測肝癌HepG2細胞克隆能力:取對數(shù)期肝癌HepG2細胞，消化、計數(shù)后以200個/孔接種于6孔板， 12 h貼壁后更換培養(yǎng)基并添加終濃度為20、40、80 μg/ml羥考酮處理48 h，設為OT-20組、OT-40組、OT-80組，另設NC組，每組6個重復。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，出現(xiàn)肉眼可見的克隆集落時停止培養(yǎng)。甲醛固定后，瑞士染色液染色，倒置顯微鏡下觀察，細胞數(shù)>50個細胞團作為克隆計數(shù)，重復3次取平均值。平板克隆形成率=(平均克隆數(shù)/每孔加入單細胞數(shù))×100%。

1.2.4 AnnexinV-FITC/ PI雙染法檢測肝癌HepG2細胞凋亡情況:取對數(shù)期肝癌HepG2細胞約2×105個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合至80%，分組設置同1.2.3。具體操作參照試劑盒說明書，于流式細胞儀檢測肝癌HepG2細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

1.2.5 WB檢測肝癌HepG2細胞中凋亡相關蛋白及PI3K/Akt通路相關蛋白水平:收集1.2.3中各組肝癌HepG2細胞，嚴格按照蛋白提取試劑盒操作說明提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后，置于-80℃保存?zhèn)溆?。具體操作參照文獻[9]，蛋白樣品采用6% SDS-PAGE膠進行電泳，濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋，加一抗(Bcl-2抗體 1∶500；Bax抗體 1∶500；PTEN抗體 1∶500；AKT、p-AKT抗體 1∶1 000；PI3K抗體1:50，p-PI3K抗體1∶1 000，cleaved-Caspase3抗體 0.1～0.2 μg/ml；GAPDH抗體 1∶500)4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3次，20 min/次，用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育 1.5 h，洗膜，顯色，曝片，觀察結果并進行分析。

2 結果

2.1 羥考酮對肝癌細胞HepG2增殖的影響 與NC組比較， OT-1組、OT-10組、OT-20組、OT-40組肝癌HepG2細胞增值抑制率呈時間依賴性依次增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中OT-40組、OT-80組肝癌HepG2細胞增值抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。OT-40組48 h時，肝癌HepG2細胞抑制率為50.27%，接近半數(shù)抑制濃度(IC50)，因此將40 g/ml作為羥考酮最佳濃度，48h作為最佳作用時間用于下游試驗。見表1。

表1 不同濃度羥考酮對肝癌HepG2細胞增值抑制的影響

2.2 羥考酮對肝癌細胞HepG2平板克隆形成率的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組肝癌細胞HepG2平板克隆形成率呈濃度依賴性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 平板克隆形成率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

2.3 羥考酮對肝癌細胞HepG2凋亡的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2 凋亡率增加(P<0.05)，OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2凋亡的影響

表3 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2凋亡的影響 n=6

2.4 羥考酮對肝癌細胞HepG2中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2中Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4，圖3。

圖3 WB檢測肝癌細胞HepG2中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達

表4 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達的影響

2.5 羥考酮對PI3K/Akt通路相關蛋白的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2中p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平降低(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平升高(P<0.05)。OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 中p-PI3K、p-Akt、PTEN蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，PI3K、Akt蛋白在4組中表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4，表5。

圖4 WB檢測肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt通路相關蛋白表達

表5 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt通路相關蛋白表達的影響

3 討論

羥考酮是一種半合成的蒂巴因衍生物具有與嗎啡相似的鎮(zhèn)痛效果及不良反應，同屬于強阿片類藥物，但等效果口服羥考酮劑量是嗎啡的1/2，且羥考酮不良反應輕微，生物利用度比較高，給藥途逕較多，因而應用廣泛。羥考酮主要通過激活受體、κ受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，目前在臨床中主要用于癌痛和急慢性非癌性疼痛的治療,也可用于患者術后鎮(zhèn)痛，可以有效地改善癌痛患者的生活質(zhì)量，應用前景比較廣闊[10,11]。本研究首先用不同濃度的羥考酮處理肝癌HepG2細胞，發(fā)現(xiàn)與NC組比較，羥考酮可能呈濃度依賴的抑制肝癌HepG2細胞增殖，且40 g/ml時的羥考酮作用48 h時，肝癌HepG2細胞抑制率為50.27%，接近半數(shù)抑制濃度，因此以40 g/ml羥考酮為最佳處理濃度，48 h為最佳作用時間用于下游試驗。

田蜜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，羥考酮可通過下調(diào)Bcl-2 mRNA，上調(diào)Bax mRNA抑制肺腺癌A549細胞增殖，促進其凋亡，減弱其遷移，且效果均比嗎啡好。葉元梅等[5]研究報道，羥考酮預先給藥處理，可以上調(diào)大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平，下調(diào)Bax蛋白水平，減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞的凋亡。Bcl-2定位于線粒體外膜，屬于抗凋亡蛋白，可以促進細胞存活抑制細胞凋亡。Bax同屬于Bcl-2家族，屬于凋亡蛋白，可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產(chǎn)生抑制作用，半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinylaspartate special protein，Caspace)家族包含多種亞基，主要以酶原(uncleaved)形式存廣泛存在于細胞中，其中cleaved-Caspace3、cleaved-Caspace3、cleaved-Caspace8、cleaved-Caspace9等在細胞凋亡中起決定性作用[13]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，羥考酮可呈濃度依賴抑制肝癌HepG2細胞平板克隆形成率、促進其凋亡，上調(diào)Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平，下調(diào)Bcl-2蛋白表達水平，且以終濃度40 g/ml時的作用最佳，提示羥考酮可能通過上調(diào)Bax、cleaved-Caspase3蛋白、下調(diào)Bcl-2蛋白水平，抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡。

PI3K/Akt通路在多種人類腫瘤中表達失調(diào)，Akt被PI3K磷酸化激活后可調(diào)控細胞周期、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等，PI3K同時具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，可使細胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化后變成第二信使，與其下游效應分子Akt結合后使Akt發(fā)生磷酸化變成p-Akt，進而可編碼下游凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2等[14,15]。磷酸酶及張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)是一種重要抑癌基因，可負調(diào)控PI3K/Akt通路，PTEN在癌細胞中下調(diào)表達，其表達與腫瘤進展、淋巴結轉(zhuǎn)移及預后不良有關[16]。PTEN可通過磷脂酸梅活性降解PI3K活化，是PI3K失去對Akt激活能力，抑制PI3K/Akt通路[17-19]。張萌等[20,21]研究報道，羅格列酮可通過上調(diào)PTEN抑制PI3K/Akt通路抑制肝癌HepG2細胞增殖。Chen等[22-25]研究報道，石斛酚可增強caspase-3、PARP和p53蛋白抑制PI3K/Akt通路激活，抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2中p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平降低(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平升高，且40 g/ml羥考酮作用效果最佳，提示羥考酮可能通過上調(diào)PTEN，抑制PI3K/Akt通路激活，抑制肝癌細胞HepG2增殖，促進其凋亡。

綜上所述，羥考酮可抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡，可能與通過上調(diào)Bax、cleaved-Caspase3、PTEN，下調(diào)Bcl-2蛋白，抑制PI3K/Akt通路活化有關系。但羥考酮抑制肝癌HepG2細胞的增殖，促進其凋亡過程中是否還涉及到其他的通路參與，以及PI3K/Ak通路上下游分子表達狀態(tài)仍然未知，后期仍需進一步深入探究。