微小RNA-429過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖侵襲的影響

喻建 牟文輝 向英豪 王波涌

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率與死亡率[1]。研究顯示，細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移速度快是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的主要特點(diǎn)[2]，因而探究乳腺癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)而尋求治療新靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。研究表明，微小RNA-429(miR-429)在非小細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，可參與細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等生物學(xué)行為[3]。研究表明，Wnt/β-鏈蛋白(β-catenin)經(jīng)典通路可參與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程[4]。研究顯示，miR-429可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖及侵襲[5]。然而關(guān)于miR-429與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展的研究筆者所見較少。因此，本研究旨在通過miR-429過表達(dá)分析其對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及Wnt信號通路的影響，進(jìn)一步揭示乳腺癌發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年8月至2018年6月在利川市人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的76例乳腺癌患者的癌組織標(biāo)本為乳腺癌組，另選取距癌組織邊緣>5 cm的對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本為癌旁組?；颊呓?jīng)病理證實(shí)為Ⅰ～Ⅱ型，手術(shù)切除組織迅速置于10%甲醛中。患者年齡28～79歲，平均年齡(52.6±7.6)歲。

1.2 主要試劑與儀器 乳腺癌細(xì)胞MCF-7(TCHu74)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液與10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自美國Gibco公司；MTT檢測試劑盒購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；miR-429陰性對照質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥有限公司；Trizol Reagent核酸分離試劑購自日本Takara公司；FastQuant RT Kit(RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒)與SYBR Green試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；兔抗β-鏈蛋白(β-catenin)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3)一抗均購自美國Bioworld公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗均購自美國ROCKLAND公司；ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白1(CyclinD1)、原癌基因c-Myc抗體均購自美國Abcam公司；Matrigel基質(zhì)膠購自上海前塵生物科技有限公司；Transwell小室購自美國BD公司；BCA試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL化學(xué)發(fā)光劑試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；D30型核酸蛋白測定儀及凝膠成像儀購自德國Eppendorf公司；TE70X型半干轉(zhuǎn)膜儀購自上海帝博思生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率檢測:取凍存MCF-7細(xì)胞，恒溫水浴鍋解凍(37℃)1～2 min，置于含10%胎牛血清及100倍稀釋的青鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5%CO2、37℃)，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到約80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶液消化。傳代培養(yǎng)后取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將LipofectaminTM 2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋輕輕混勻，室溫孵育5 min，另將miR-429 mimics、陰性對照分別稀釋于500 μl無血清培養(yǎng)基中使終濃度為20 μmol/L，室溫孵育5 min，將稀釋的脂質(zhì)體與稀釋的miR-429 mimics混合，輕輕混勻，室溫孵育20 min，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)孔，另設(shè)不添加轉(zhuǎn)染試劑作為空白組。6 h后棄去培養(yǎng)基，更換含10%胎牛血清的RPMI 146培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后將培養(yǎng)板置于倒置熒光顯微鏡下觀察，鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及法綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。當(dāng)轉(zhuǎn)染效率80%時(shí)，加入嘌呤霉素進(jìn)行壓力篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-429表達(dá):取出超低溫冰箱內(nèi)保存乳腺癌組、癌旁組組織以及空白組、miR-429 mimics、miR-429 NC組各組細(xì)胞參照Trizol Reagent核酸分離試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。miR-429以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-429相對表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖:收集對數(shù)期的MCF-7細(xì)胞，加入100 μl細(xì)胞懸液(密度為1×105個(gè)/ml)，每組設(shè)置4個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后棄原培養(yǎng)液，每孔分別加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，分別加入DMSO溶液(100 μl)震蕩，采用酶標(biāo)儀分別檢測細(xì)胞0、24、48、72、96 h時(shí)的吸光度值(570 nm波長)，重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白組吸光值-試驗(yàn)組吸光值)/空白組吸光值×100%。

1.3.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn):分別取各組處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，胰蛋白酶(0.25%)消化后制備單個(gè)細(xì)胞懸液并接種于6孔板(細(xì)胞密度500個(gè)/ml)，放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆細(xì)胞，PBS清洗，甲醇(100%)固定15 min，結(jié)晶紫液(0.1%)染色15 min，清洗后自然晾干。顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)目并計(jì)算克隆形成率，克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.5 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力:細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室上室底膜表面鋪Matrigel膠(40 μl 2.0 mg/ml)，室溫孵育30 min，收集各組MCF-7細(xì)胞，采用無血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整MCF-7細(xì)胞濃度(2×105個(gè)/ml)，首先在Transwell小室的上室加入100 μl細(xì)胞懸液，其次在下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(600 μl)，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上室培養(yǎng)液，采用無水甲醇固定，30 min后擦去上室未透過膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫(0.1%)染色20 min，將其置于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測ki67、MMP-2、MMP-9、細(xì)胞核β-catenin、細(xì)胞質(zhì)β-catenin、CyclinD1和c-myc蛋白表達(dá)情況：收集各組MCF-7細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白并采用BCA法檢測各蛋白濃度，其中核蛋白提取參照Active Motif公司細(xì)胞核提取蛋白說明書。分別取20 μg蛋白上樣于SDS-PAGE分離蛋白，將各蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h，分別加入各蛋白稀釋比為1∶1 000一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗，加入稀釋比為1∶5 000二抗，室溫孵育1 h，采用ECL法檢測免疫復(fù)合物表達(dá)，其中核β-catenin蛋白以Lamin B為內(nèi)參，其他蛋白均以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Chemi Imager 5500V2.03軟件分析各蛋白條帶，并采用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算個(gè)條帶整合光密度值，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶光密度值/內(nèi)參照條帶光密度值。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組和乳腺癌組中miR-429表達(dá)水平比較 與癌旁組(1.05±0.20)比較，乳腺癌組的(0.51±0.11)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.624，P<0.05)。

2.2 陰性轉(zhuǎn)染組、MiR-429 mimics組轉(zhuǎn)染效果檢測倒置熒光顯微鏡下觀察陰性轉(zhuǎn)染組、miR-429 mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均>90%。miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞中miR-429表達(dá)水平顯著高于空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 倒置顯微鏡下觀測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(丫啶橙和碘化丙啶染色×100)

表2 3組miR-429表達(dá)水平比較

2.3 CCK-8法檢測空白組、陰性轉(zhuǎn)染組、miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞增殖情況 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，不同時(shí)間點(diǎn)miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-429過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.4 平板克隆法檢測空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組、miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞增殖情況 與空白對照組相比，陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-429 mimcs組克隆細(xì)胞形成率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組MCF-7細(xì)胞克隆形成率

2.5 Transwell法檢測空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組、miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞侵襲能力 miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞侵襲數(shù)量均顯著低于空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見表5,圖2。

表5 miR-429過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

2.6 空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組、miR-429 mimics組增殖、侵襲及Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá) Western Blot法檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67、細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白MMP-2與MMP-9及Wnt信號通路相關(guān)蛋白Wnt、GSK-3β、β-Catenin蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-429 mimics組ki67、MMP-2、MMP-9、Wnt、GSK-3β、β-Catenin蛋白表達(dá)均顯著低于空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見表6，圖3。

表6 MCF-7細(xì)胞中ki67、MMP-2、MMP-9、Wnt、GSK-3β、β-Catenin蛋白表達(dá)

圖3 MCF-7細(xì)胞中ki67、MMP-2、MMP-9、Wnt、GSK-3β、β-Catenin蛋白表達(dá)

3 討論

乳腺癌病情發(fā)展迅速，目前臨床主要采用手術(shù)治療方法，由于乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及浸潤能力強(qiáng)，導(dǎo)致其極易發(fā)生轉(zhuǎn)移[6,7]。因而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲對控制其發(fā)生、發(fā)展及改善患者預(yù)后均具有重要意義。miRNA已成為乳腺癌研究重點(diǎn)[8]，miR-429是微小RNA-200(miR-200)家族的重要成員，其位于人染色體1p36.33，研究表明miR-429在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)并可參與腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲等生物學(xué)過程[9,10]，但有關(guān)miR-429在乳腺癌中研究較少。因此，本研究分析miR-429與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系，并初步探討其可能作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-429表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)，提示miR-429在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)。倒置熒光顯微鏡鏡下觀察以及qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-429 mimics組miR-429表達(dá)水平明顯升高，提示轉(zhuǎn)染效果佳可用于后續(xù)研究。CCK8試驗(yàn)顯示顯示miR-429過表達(dá)組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率明顯高于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組，而MCF-7細(xì)胞克隆形成率、細(xì)胞侵襲數(shù)量均明顯降低，提示miR-429過表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞增殖侵襲能力，但具體機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示miR-429 mimics組MCF-7細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)明顯低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin表達(dá)明顯升高，說明miR-429過表達(dá)阻止β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)而抑制EMT發(fā)生，類似研究亦證實(shí)[11-13]，提示miR-429可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲。Wnt信號通路其異?；罨纱龠M(jìn)細(xì)胞增殖、分化及侵襲進(jìn)而導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展，癌基因激活或抑癌基因失活均可激活Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而激活下游靶基因CyclinD1、c-Myc等導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生及發(fā)展，而抑制Wnt/β-catenin信號通路可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲[14-16]。Wnt/β-catenin信號通路激活可抑制GSK-3β活性從而避免β-catenin被其磷酸化導(dǎo)致β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，研究表明β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象是Wnt/β-catenin信號通路激活的標(biāo)志[17,18]。然而，腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲受多種基因調(diào)控，研究表明ki67與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)并可作為增殖期腫瘤的重要標(biāo)志物，而MMP-2與MMP-9可作為惡性腫瘤細(xì)胞侵襲的標(biāo)志物[19,20]。本研究結(jié)果顯示miR-429 mimics組ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均明顯降低，進(jìn)一步分析Wnt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-429 mimics組GSK-3β、Wnt蛋白表達(dá)水平均明顯低于空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組，說明miR-429過表達(dá)后可明顯抑制Wnt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，提示miR-429可能通過抑制Wnt信號通路進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲。

綜上所述，miR-429過表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，其可能通過抑制Wnt信號通路發(fā)揮作用，可為乳腺癌分子診斷及靶向治療提供理論基礎(chǔ)。本研究存在不足之處：miR-429與Wnt信號通路的具體作用機(jī)制及其與其他可能信號通路的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。