miR-26在大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用與機(jī)制研究

李巍 呂彥 張景華 趙子艾 孫顯輝 劉欣 趙永剛

腦缺血是臨床上致殘率與病死率都很高的疾病，好發(fā)于中老年，男性發(fā)病率略高于女性。該病起病急、進(jìn)展快，治療上需要改善血腫周圍腦血流、減輕腦水腫[1]。研究認(rèn)為腦缺血不僅會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞突起損傷，還會誘發(fā)腦缺血再灌注神經(jīng)損傷。腦缺血再灌注神經(jīng)損傷是指腦組織缺血導(dǎo)致局部腦細(xì)胞損傷，恢復(fù)血液再灌注后的腦缺血反應(yīng)進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[2,3]。腦缺血再灌注神經(jīng)損傷的具體發(fā)生機(jī)制還不明確，不過局部腦缺血可使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生從靜止?fàn)顟B(tài)到促炎狀態(tài)的改變，促使了血腦屏障的破壞和白細(xì)胞聚集[4,5]。腦缺血的發(fā)生伴隨有許多基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中微小RNA(MicroRNA，miRNA)可能同樣參與該病的發(fā)生發(fā)展[6]。miRNA是一種短小的非編碼RNA分子，其通過聯(lián)結(jié)mRNA中的3’-非翻譯區(qū)位點(diǎn)來調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，從而發(fā)揮對疾病的調(diào)控作用[7,8]。miR-26是microRNAs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成之一，位于人類22q11.21，其在腫瘤中為抑癌基因，在多種癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢[9,10]。miR-26被證明不同的神經(jīng)細(xì)胞中存在表達(dá)變化[11,12]，但是與腦缺血再灌注神經(jīng)損傷的關(guān)系還不明確。Apba-1編碼X11蛋白，后者是一個(gè)與阿爾茲海默病淀粉樣前體蛋白，可調(diào)節(jié)胞外分泌的神經(jīng)元黏附力與腦組織囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號轉(zhuǎn)換過程[13,14]。本文探討miR-26在大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用與機(jī)制，希望為今后的研究提供新的靶點(diǎn)，為臨床患者提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇健康雄性SD大鼠48只(動物許可證號：SCXK2019-0041)，體重(240±20)g，由學(xué)科學(xué)院動物中心提供。大鼠置于獨(dú)立通風(fēng)籠盒分籠飼養(yǎng)，每籠5只，籠內(nèi)溫度為20℃～23℃，濕度為40%～60%。喂養(yǎng)配制的大鼠飼料，飲純凈水，墊料每2天更換1次，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Apba-1一抗(北京百奧萊博科技有限公司)、Trizol 試劑(美國Invitrogen 公司)、mRNA檢測試劑盒(日本Takara 公司)、β-actin鼠單克隆抗體(北京四季青公司)、miR-26 mimic與miR-NC(上海生工公司)。

1.2 動物分組與處理 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、miR-26 mimic組和miR-NC組，每組12只。模型組、miR-26 mimic組和miR-NC組都制備腦缺血再灌注模型，采用線栓法建立模型，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.33 ml/100 g)大鼠，切開頸部正中2～3 cm，進(jìn)行鈍性分離，暴露頸部組織，用動脈夾夾緊頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端和頸總動脈近心端并剪斷枕動脈，插入魚線線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈，當(dāng)感受到阻力之后，停止進(jìn)線，扎緊并固定魚線，褪去動脈夾后造模完成，將大鼠放置于籠內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。腦缺血2 h后，用彎鑷夾住魚線尾部后緩慢的退出魚線，剪斷露在體外的線栓，建立腦缺血再灌注神經(jīng)損傷模型，然后自由喂食和水。造模后1、3、7 d，4組分別取4只大鼠。將9 μl無菌0.9%氯化鈉溶液、miR-26 mimic、miR NC(100 μmol/L)與2.5 μl的轉(zhuǎn)染試劑混合均勻靜置30 min。選擇大鼠頭部正中切口，將混合液注射大鼠左側(cè)腦室，注射速度約為3 μl/min，留針時(shí)間5 min，在處理后6 h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測與判定。整個(gè)過程維持肛溫在(37.0±0.5)℃，自由取食、供水。

1.3 觀察指標(biāo) (1)按照Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，分為0～4分，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)行為功能越好[2]。(2)斷頭處死大鼠，取腦組織并冷卻至-20℃ 30 min，制成1 mm厚的切片， 37℃恒溫下固定10 min并進(jìn)行HE染色，正常組織呈紅色，梗死組織呈白色。使用Image-Pro Plus分析大鼠腦梗死和腦水腫的體積百分比。(3)取部分腦組織，用液氮保存，一部分用于miRNA檢測分析，一部分用于蛋白表達(dá)檢測分析。在miRNA檢測分析上，將腦組織進(jìn)行液氮下研磨，加入1 ml Trizol進(jìn)行研磨15 min左右，提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照qRT-PCR試劑盒中的說明書檢測miR-26表達(dá)水平，反應(yīng)條件：95℃ 10 s，60℃ 20 s，72 ℃ 15 s，反應(yīng)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，結(jié)果以目的基因與GAPDH mRNA 表達(dá)值的比值表示。U2的正向引物：5’-ACCGGCCATTTAAACCTTACA-3’，反向引物：5’-AGGGGGGGGCCATTAC-3’。miR-26的正向引物：5’-GCTGGGTTGAGAGGGCGA-3’， 反向引物：5’-ATTCCCACTGGACACAAAC-3’，用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的表達(dá)。采用Western Blot 檢測蛋白表達(dá)配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，轉(zhuǎn)膜后用含50 g/L 脫脂奶粉的TBST在37℃下封閉1.5～2 h；兔抗鼠的Apba-1 單克隆抗體(1∶1 000稀釋)和β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜；TBST洗滌3次，在室溫下孵育二抗1 h(HRP 標(biāo)記的IgG羊抗兔，1∶5 000稀釋)；TBST洗滌3次后，采用自動發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組大鼠均造模成功，3組造模后1、3、7 d的Tarlov評分都顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)行為學(xué)評分比較 n=4,分，

2.2 4組大鼠腦水腫與腦梗死體積比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的腦水腫與腦梗死相對體積顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著低于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)的腦水腫與腦梗死相對體積比較

2.3 4組大鼠miR-26 mRNA表達(dá)水平比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的miR-26 mRNA相對表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)的miR-26 mRNA相對表達(dá)水平比較

2.4 4組大鼠Apba-1蛋白表達(dá)水平比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的Apba-1蛋白相對表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表4,圖1。

表4 4組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)的Apba-1蛋白相對表達(dá)水平比較

圖1 4組造模后不同時(shí)間點(diǎn)的Apba-1蛋白相對表達(dá)水平

3 討論

當(dāng)前腦缺血還無特效治療方法，但是規(guī)范化治療與管理可有效降低病死率，改善患者的預(yù)后[15,16]。腦缺血的好發(fā)部位包括大腦中動脈、大腦前動脈、頸內(nèi)動脈、大腦后動脈等，從而出現(xiàn)缺血、缺氧性神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致患者死亡[17]。同時(shí)腦缺血不僅會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞突起損傷，還可造成腦缺血再灌注神經(jīng)損傷，誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)記憶、語言、行動能力等障礙。線栓法大鼠大腦中動脈梗死是當(dāng)今探索腦缺血再灌注神經(jīng)損傷的主要動物模型，主要是采用人為物理方法阻塞大鼠大腦中動脈，使大鼠腦組織形成缺血性梗死及相應(yīng)的神經(jīng)損傷[18,19]。

miRNA作為致病基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)靶mRNA 的表達(dá)，從而影響相應(yīng)蛋白的翻譯，對機(jī)體的生理功能與病理功能產(chǎn)生相應(yīng)的影響[20]。有研究顯示，在腦缺血再灌注神經(jīng)損傷模型中，miR-26的表達(dá)顯著增加[21,22]。本研究也顯示模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的miR-26 mRNA相對表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。miR-26基因組存在著有兩個(gè)基因位點(diǎn)，分別位于在11號染色體、21號染色體。miR-26的表達(dá)調(diào)控在基因水平、染色體水平和轉(zhuǎn)錄水平有著重要作用，且可抑制癌基因的過量表達(dá)，從而抑制腫瘤的發(fā)生[23,24]。

當(dāng)前miRNA已經(jīng)被廣泛研究并且已經(jīng)活躍在細(xì)胞的生長、凋亡、增殖、分化等過程中，miRNA通過調(diào)節(jié)其靶基因參與缺血性腦梗死的病理生理學(xué)的進(jìn)程，也在神經(jīng)突延伸和分支中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[25,26]。本研究顯示模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組大鼠均造模成功，3組造模后1、3、7 d的Tarlov評分顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)；模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的腦水腫與腦梗死相對體積顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著低于模型組與miR-NC組(P<0.05)，表明miR-26的過量表達(dá)能抑制腦水腫與腦梗死，從而改善大鼠的神經(jīng)行為功能。miR-26是一類高度保守的內(nèi)源性小RNA，可以調(diào)節(jié)組織血管生成，并誘導(dǎo)缺血情況下的一系列變化，腦缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[27,28]。有研究顯示注射miR-1、miR-21和miR-26可減少非熱休克誘導(dǎo)的心臟缺血再灌注損傷大鼠的心肌梗死體積[29,30]。還有研究顯示miR-26在星型膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)是下調(diào)的，并且可以抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。miR-26作為腦缺血miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要成員之一，被預(yù)測在星型膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)可能上調(diào)并與腦缺血再灌注神經(jīng)損傷相關(guān)[31,32]。

腦缺血再灌注神經(jīng)損傷是高度復(fù)雜的機(jī)制，涉及到炎性反應(yīng)，導(dǎo)致缺血性神經(jīng)元缺血和壞死性死亡[33]。腦缺血再灌注神經(jīng)損傷發(fā)生的病理生理變化并不是完全定型和不可逆的，尋找有效保護(hù)再灌注神經(jīng)損傷的治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。miRNA的異常表達(dá)和一些疾病的發(fā)生發(fā)展有著緊密關(guān)系。沉默miR-26可以減弱神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖并且增加激酶抑制因子2A表達(dá)，從而在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用[34]。Apba-1是腦缺血的關(guān)鍵分子，通過TargetScan 和MiRanda 等預(yù)測分析軟件預(yù)測miR-26可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Apba-1水平[35]。本研究顯示模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的Apba-1蛋白相對表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)，表明miR-26的高表達(dá)能促進(jìn)Apba-1的表達(dá)，從而在腦缺血再灌注神經(jīng)損傷中起作用。

綜上所述，miR-26在大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)損傷中的過量表達(dá)能促進(jìn)Apba-1的表達(dá)，從而抑制腦水腫與腦梗死，改善大鼠的神經(jīng)行為功能，發(fā)揮相應(yīng)的腦功能保護(hù)作用。