miR-138靶向GRK6調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的研究

樊萍 馮秀媛 胡楠 蒲丹 呂曉虹 孫怡寧 何嵐

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者臨床表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)僵硬、疼痛、腫脹等，性別、年齡及炎性反應(yīng)等多種因素均與OA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。OA病理特征主要為關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)減少，軟骨細(xì)胞是軟骨組織中主要細(xì)胞類型，且具有維持軟骨完整性功能，并可有效維持軟骨損傷及重構(gòu)的平衡關(guān)系[2,3]。研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可通過調(diào)控軟骨組織降解及軟骨細(xì)胞凋亡而參與OA發(fā)生及發(fā)展過程[4,5]。但部分miRNA在OA發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。通過尋找新型miRNA探究其在OA致病機(jī)制中的作用有助于尋找治療該病的新方法。研究表明微小RNA-138(microRNA-138，miR-138)通過抑制WNT/β-Catenin信號(hào)通路而促進(jìn)NEK2誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞存活[6]。但關(guān)于miR-138如何通過調(diào)控下游靶基因而發(fā)揮作用尚未可知。靶基因預(yù)測顯示G蛋白偶聯(lián)受體激酶 6(G protein-coupled receptor kinase 6，GRK6)可能是miR-138的靶基因，有研究指出抑制GRK6表達(dá)可減弱IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，減輕軟骨細(xì)胞炎癥損傷[7]。但OA軟骨細(xì)胞中GRK6的表達(dá)水平是否受miR-138表達(dá)的影響尚未可知。因此，本研究通過探討miR-138與GRK6的靶向調(diào)控作用，分析其對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響及潛在作用機(jī)制，以期為OA治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 慶大霉素、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自上海生工生物工程有限公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；miR-138 mimics與無意義小分子陰性對(duì)照片段(miR-con)、GRK6小干擾RNA(si-GRK6)及陰性對(duì)照(si-con)均購自美國Invitrogen公司；青霉素與鏈霉素均購自美國Sigma公司；兔抗人GRK6、Bcl-2、Bax抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；miR-138、U6、GRK6、β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人原代OA細(xì)胞分離及培養(yǎng):選取2015年2月至2018年3月我院經(jīng)關(guān)節(jié)鏡清理及膝關(guān)節(jié)清理的OA患者30例為研究對(duì)象(OA組)，其中男16例，女14例；年齡53～65歲，平均年齡(58.62±7.36)歲；根據(jù)國際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，患者宏觀評(píng)分均為Ⅰ級(jí)損傷[8]。同時(shí)選取同期醫(yī)院急診外科就診的緊急創(chuàng)傷性截肢患者5例(Normal組)，切取正常軟骨標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者；化膿性關(guān)節(jié)炎患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情且簽署同意書。參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]分離軟骨細(xì)胞：無菌條件下，剪切OA患者軟骨標(biāo)本及非OA患者正常軟骨標(biāo)本，去除標(biāo)本多余纖維結(jié)締組織，軟骨組織剪切成方塊(1 cm3)，PBS(含有青霉素鈉、慶大霉素雙抗)洗滌5次，加入0.25%胰蛋白酶消化，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 min，棄上清，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)消化16 h，每隔4 h收集細(xì)胞，用200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，4℃條件下，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，用含有10%胎牛血清及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)(密度1×105/ml)，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期軟骨細(xì)胞接種于6孔板(密度1×105/ml)，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定軟骨細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:取對(duì)數(shù)生長期OA軟骨細(xì)胞，以1×105/ml的密度接種于6孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后收集細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑試劑盒說明書分別將miR-138 mimics與miR-NC轉(zhuǎn)染至OA軟骨細(xì)胞，分別為OA+miR-138組、OA+miR-con組。為探究GRK6對(duì)OA軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究分別將si-GRK6與si-con轉(zhuǎn)染至OA軟骨細(xì)胞，分別為OA+si-GRK6組、OA+si-con組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中為驗(yàn)證miR-138是否通過抑制GRK6表達(dá)而影響OA軟骨細(xì)胞增殖及凋亡，分別將GRK6過表達(dá)載體(pcDNA-GRK6)與空載體(pcDNA)分別與miR-138 mimics共同轉(zhuǎn)染至OA軟骨細(xì)胞，分別為OA+miR-138+pcDNA -GRK6組、OA+miR-138+pcDNA組。轉(zhuǎn)染6 h后更換為RPMI 1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.2.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-138、GRK6 mRNA表達(dá)水平:用Trizol試劑分別提取各組軟骨細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒配置反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。miR-138、GRK6 及其內(nèi)參引物分別為：miR-138正向引物：5’-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3’，反向引物：5’-TGGTGTCGTG GAGTCG-3’；U6正向引物：5’-CTC

GCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCAC

G AATTTGCGT-3’；GRK6 正向引物：5’-CAGCCCATG

GAGCTCGAGAA C-3’，反向引物：5’-G GTGCA AACTGTTAAACGGCGC-3’；β-actin正向引物：5’-TGCTGT CCCTGTATGCCT CT-3’，反向引物：5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，正反向引物各1 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。應(yīng)用LightCycler 480熒光定量PCR儀收集熒光信號(hào)并分析溶解曲線，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-138、GRK6 mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):OA軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞以3×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板，每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl DMSO，分別于作用時(shí)間24 h、48 h、72 h時(shí)在490 nm波長下應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度值(OD)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):收集各組OA軟骨細(xì)胞，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，10 000 r/min轉(zhuǎn)速(4℃)離心5 min，棄上清，依次加入5 μl膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)與碘化丙錠(PI)，充分混勻，室溫避光孵育20 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):分別構(gòu)建野生型(GRK6-WT)與突變型GRK6-3’UTR序列的報(bào)告基因質(zhì)粒(GRK6-MUT)，收集對(duì)數(shù)生長期OA軟骨細(xì)胞，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行miR-138 mimics與GRK6熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染，OA軟骨細(xì)胞分為GRK6-WT+miR-138 mimics共轉(zhuǎn)染組；GRK6-WT+miR-con共轉(zhuǎn)染組；GRK6-MUT+miR-138 mimics共轉(zhuǎn)染組；GRK6-MUT+miR-con共轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測不同組相對(duì)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測GRK6、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá):收集各組對(duì)數(shù)生長期軟骨細(xì)胞，加入預(yù)冷RIPA緩沖液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，參照BCA蛋白濃度測定，按照試劑盒說明書檢測蛋白濃度并定量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳反應(yīng)分離蛋白，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入蛋白一抗(稀釋比1∶1 000)放入4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入相應(yīng)二抗混合(稀釋比1∶2 000)，TBST洗滌，ECL顯影，曝光，應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-138和GRK6在人原代OA軟骨細(xì)胞及正常細(xì)胞中的表達(dá) OA軟骨細(xì)胞中miR-138的表達(dá)水平顯著低于Normal組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GRK6 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1,表1。

圖1 Westen blot檢測人原代OA軟骨細(xì)胞及正常細(xì)胞中GRK6蛋白的表達(dá)

表1 人原代OA軟骨細(xì)胞及正常細(xì)胞中miR-138和GRK6的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染miR-138對(duì)人原代OA軟骨細(xì)胞增殖的影響 與Normal組比較，OA組軟骨細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OA軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138 mimics后，與OA+miR-con組比較，軟骨細(xì)胞活力顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-138對(duì)人原代OA軟骨細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-138過表達(dá)對(duì)人OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響 相對(duì)于Normal組，OA組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與OA+miR-con組相比，OA+miR-138組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Western blot檢測結(jié)果顯示，OA組軟骨細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與OA+miR-con組比較，OA+miR-138組軟骨細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 轉(zhuǎn)染miR-138對(duì)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.4 沉默GRK6對(duì)人OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與OA+si-con組比較，OA+si-GRK6組軟骨細(xì)胞增殖活力顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 Western blot檢測GRK6、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

表4 沉默GRK6對(duì)人OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 miR-138靶向調(diào)控GRK6的表達(dá) 靶基因預(yù)測顯示miR-138與GRK6的3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-con、GRK6-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-138 mimics、GRK6-WT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-con、GRK6-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-138 mimics、GRK6-MUT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。Western blot法檢測結(jié)果顯示，與miR-con組比較，miR-138組細(xì)胞中GRK6蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與anti-miR-con組比較，anti-miR-138組細(xì)胞中GRK6蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。見圖4,表5、6。

圖4 miR - 138靶向調(diào)控GRK6的表達(dá)；A：GRK6的3’UTR中含有與miR-138互補(bǔ)的核苷酸序列；B：Western blot法檢測miR-138對(duì)GRK6蛋白表達(dá)的影響

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6 過表達(dá)GRK6逆轉(zhuǎn)了miR-138對(duì)人OA軟骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)和凋亡的抑制作用 與OA+miR-138+

表6 miR-138調(diào)控GRK6的表達(dá)

pcDNA組比較，OA+miR-138+pcDNA -GRK6組軟骨細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖5,表7。

圖5 Western blot檢測GRK6、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

表7 過表達(dá)GRK6逆轉(zhuǎn)了miR-138對(duì)人OA軟骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)和凋亡的抑制作用

3 討論

miRNA屬于一類內(nèi)源性非編碼RNA，可通過抑制下游靶基因翻譯或促進(jìn)靶基因降解而參與細(xì)胞增殖、凋亡及器官發(fā)育等多種生理病理過程，研究表明miR-138在肝細(xì)胞癌等多種腫瘤組織或細(xì)胞系中呈低表達(dá)，并可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-13]。研究表明miR-138可通過靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)而調(diào)控膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡[14]。相關(guān)研究報(bào)道指出年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體囊膜中miR-138表達(dá)上調(diào)，其可通過靶向負(fù)性調(diào)控SIRT1表達(dá)促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[15]，與其研究結(jié)果不同，本研究結(jié)果顯示，OA軟骨細(xì)胞中miR-138的表達(dá)下調(diào)，分析原因可能為不同組織或細(xì)胞miR-138表達(dá)不同。因此miR-138在OA軟骨細(xì)胞中的作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-138表達(dá)后，OA軟骨細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，已有研究報(bào)道指出Bcl-2、Bax基因在軟骨細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，上調(diào)Bcl-2表達(dá)及下調(diào)Bax表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，探究根本原因在于其可阻斷細(xì)胞內(nèi)部自身凋亡機(jī)制的啟動(dòng)[16]。說明miR-138過表達(dá)可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡基因表達(dá)而抑制OA軟骨細(xì)胞過度凋亡。提示miR-138過表達(dá)可能是抑制OA軟骨破壞的重要機(jī)制。

GRK6在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿及其細(xì)胞系中呈高表達(dá)，下調(diào)GRK6表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖[17,18]。研究表明GRK6表達(dá)水平升高可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)炎性巨噬細(xì)胞分泌、增強(qiáng)機(jī)體炎性反應(yīng)從而參與多種病理過程[19,20]。本研究結(jié)果顯示GRK6在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道[17-20]相似，說明GRK6表達(dá)水平升高可能促進(jìn)OA發(fā)生發(fā)展。本研究通過抑制GRK6表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞增殖能力升高，細(xì)胞凋亡能力明顯受到抑制，表明抑制GRK6表達(dá)與miR-138過表達(dá)對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的作用相同。進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)miR-138可靶向負(fù)性調(diào)控GRK6表達(dá)，GRK6過表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-138過表達(dá)對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的作用。說明miR-138可負(fù)向調(diào)控GRK6表達(dá)而抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。提示miR-138可能作為OA軟骨修復(fù)因子。

綜上所述，miR-138在OA軟骨細(xì)胞中低表達(dá)，而miR-138過表達(dá)可通過負(fù)性調(diào)控GRK6表達(dá)而增強(qiáng)OA軟骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，為OA治療及藥物研發(fā)提供新方向。但miR-138、GRK6能否作為OA進(jìn)展過程中的潛在靶點(diǎn)還需深入研究。