王妍 李曉 徐瑩 張俐
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的氣管、支氣管和肺組織炎癥性疾病[1],為臨床常見(jiàn)多發(fā)病,在我國(guó)中老年人群中發(fā)病率約為8.2%[2]。COPD病程久、預(yù)后差、可反復(fù)發(fā)作,急性加重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者肺氣管及支氣管炎性反應(yīng)爆發(fā)、氣道粘液高分泌,進(jìn)而嚴(yán)重影響患者肺功能,嚴(yán)重時(shí)可引起全身各器官損害,并導(dǎo)致死亡[3]。清肺化痰顆粒是由經(jīng)驗(yàn)方“清肺化痰湯”依據(jù)中醫(yī)藥理論而制成的顆粒合劑[4],研究表明,清肺化痰湯是由桑白皮、黃芩、瓜萎殼等組成的中藥方劑,可祛痰、解熱、平喘,能用于治療COPD[5];還能有效改善COPD急性加重期患者血液流變性,降低肺部炎性反應(yīng)、修復(fù)肺功能,具有良好的臨床治療效果,且安全性良好[6],但其作用機(jī)制目前還不清楚。NLRP3是組成炎性小體復(fù)合物的重要成分,激活炎性小體可使pro-caspase-1裂解為 caspase-1,參與并介導(dǎo)機(jī)體多種炎性反應(yīng)[7];臭氧誘導(dǎo)的肺部炎癥中NLRP3炎癥小體被激活,下調(diào)NLRP3表達(dá)可減輕炎癥導(dǎo)致的肺損傷[8];NLRP3炎性小體還參與COPD患者的機(jī)體炎性反應(yīng),急性加重期COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、IL-18和 IL-1β表達(dá)水平高于穩(wěn)定期患者及健康人[9],表明NLRP3炎癥小體信號(hào)是治療肺部炎癥的一個(gè)分子靶點(diǎn),可能是清肺化痰顆粒治療COPD急性加重期的作用機(jī)制。本文通過(guò)使用NLRP3炎性小體抑制劑處理COPD急性加重期大鼠,探討清肺化痰顆粒對(duì)COPD急性加重期大鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)SD大鼠60只購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXX(豫)2015-0003,雌雄各半,在清潔、安靜、通風(fēng)良好的條件下飼養(yǎng),自然光照,定時(shí)更換墊料、清理、消毒鼠籠,自由飲食、飲水、活動(dòng),溫度保持在25℃左右,相對(duì)濕度保持在約50%,噪音保持在約80分貝,氨濃度<20 mg/L。
1.1.2 主要試劑與儀器:清肺化痰顆粒購(gòu)自北京長(zhǎng)城制藥廠,生產(chǎn)批號(hào):Z11020039,每包9 g;VX-765購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司,貨號(hào):S2228;GAPDH、NLRP3、caspase-1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;大前門牌香煙購(gòu)自上海卷煙廠,焦油含量11 mg/支;大鼠IL-18、IL-1β ELISA試劑盒、兔源GAPDH、NLRP3、caspase-1一抗、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,貨號(hào)分別為:ab213909、ab100768、ab181602、ab232401、ab179515、ab150077;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、TBST緩沖液、LPS購(gòu)自北京索萊寶公司,貨號(hào)分別為:P1200、T1081、L8880;RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司,貨號(hào)分別為:9108、RR037Q/A/B、639519;RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天公司、BCA試劑盒、HE染色試劑盒,貨號(hào)分別為:P0013K、P0011、C0105等。酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkin Elmer公司,型號(hào):Elx800);蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào)分別為:Mini PROTEAN);全身體積描記法無(wú)創(chuàng)非束縛小動(dòng)物肺功能測(cè)量?jī)x(法國(guó)EMKA公司);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf股份公司,型號(hào):Centrifuge 5424R);輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、包埋機(jī)、烤片機(jī)(德國(guó) Leica 公司,型號(hào)分別為:RM2035、EG1160、HI1220);倒置顯微鏡(日本Olympus公司,型號(hào):1X70);電子天平(德國(guó)Sartorius 公司,型號(hào):BSA224S-CW);自制煙熏箱(由熏蒸滅菌箱改造而成,箱體尺寸為60 cm×60 cm×70 cm)等。
1.2 方法
1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組給藥:參照文獻(xiàn)[10]方法制備模型:以0.9%氯化鈉溶液溶解LPS配制為1 g/L 的溶液備用,將SD大鼠放置在自制的煙熏箱中煙熏,每次放入10只大鼠,點(diǎn)燃8支香煙,每天煙熏30 min,持續(xù)30 d,并在第1、14、28天做氣管插管并經(jīng)氣道滴注2 ml LPS溶液,氣道滴注當(dāng)日不進(jìn)行煙熏。觀察大鼠生理活動(dòng),出現(xiàn)精神不振、食欲減退、反應(yīng)遲鈍、咳嗽氣喘、毛色灰黃凌亂、呼吸急促、肺部聽(tīng)診出現(xiàn)雜音等癥狀,取其肺組織進(jìn)行HE染色,觀察其病理改變,出現(xiàn)肺組織氣管黏膜水腫充血、肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,融合面積擴(kuò)大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等肺損傷癥狀,表示造模成功[11]。共造模48只,分為模型組、清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+ VX-765組4組,每組12只。取12只大鼠氣管插管并經(jīng)氣道滴注0.9%氯化鈉溶液作為假手術(shù)組。清肺化痰顆粒用0.9%氯化鈉溶液稀釋配制成濃度0.1 g/ml溶液待用,清肺化痰顆粒組、清肺化痰顆粒+ VX-765組于每日上午9∶00以10 ml/kg的劑量灌胃[12];VX-765溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中,VX-765組、清肺化痰顆粒+ VX-765組于每日上午9∶00以50 mg/kg劑量腹腔注射[13],清肺化痰顆粒組于每日上午9∶00同體積腹腔注射DMSO,VX-765組于每日上午9∶00以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,模型組和假手術(shù)組于每日上午9∶00同體積腹腔注射DMSO并以等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃,持續(xù)7 d。
1.2.2 肺功能指標(biāo)測(cè)定:所有大鼠末次給藥結(jié)束24 h后放入體描箱,將生理信號(hào)遙測(cè)發(fā)射盒置于體描箱底部,同時(shí)調(diào)整監(jiān)測(cè)條件為:氣泵流量2 L/min,傳感器放大倍數(shù)500,采樣率200 Hz,輸入校準(zhǔn)-50,當(dāng)有效波形達(dá)到90%時(shí)記錄不同時(shí)間的呼吸參數(shù),采用小動(dòng)物生理信號(hào)遙測(cè)分析系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)并以小動(dòng)物肺功能軟件分析得出肺功能指標(biāo)包括呼吸頻率(frequency,f)、潮氣量(tidal volume,VT)、每分通氣量(minute ventilation,MV)、呼氣峰流值(peak expiratory flow,PEF)、吸氣阻力(resistance inspiratory,Ri)。
1.2.3 標(biāo)本采集及大鼠肺組織損傷情況檢測(cè):所有大鼠末次給藥結(jié)束24 h后,以40 mg/kg的劑量腹腔注射4%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠,將其以仰臥位固定在操作臺(tái)上,解剖并暴露雙肺、氣管、股動(dòng)脈,剪斷股動(dòng)脈放血,并在氣管下段剪一小口插入2 ml注射器針頭,以手術(shù)線結(jié)扎固定、注射器緩慢注入1 ml 0.9%氯化鈉溶液,當(dāng)大鼠左肺逐漸變得膨隆、蒼白時(shí)緩慢回抽灌洗液,然后再將液體緩緩注回肺內(nèi),如此反復(fù)3次。收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)3 ml,轉(zhuǎn)移至10 ml滅菌離心管中,4 000 r/min、4℃離心5 min,取上清儲(chǔ)存在-80℃冰箱中備用。開(kāi)胸取出肺組織,剪取約1 g儲(chǔ)存于-80℃中備用;其余肺組織以0.9%氯化鈉溶液漂洗,經(jīng)固定、梯度乙醇(從低到高)脫水、透明后以石蠟包埋,采用切片機(jī)做病理切片,經(jīng)脫蠟、梯度酒精(從高到低)浸泡后,HE染色試劑盒染色,具體按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,然后以蒸餾水漂洗、再次脫水、二甲苯透明后封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變情況并拍照,根據(jù)損傷嚴(yán)重程度做Holfbauer[14]。見(jiàn)表1。
表1 Holfbauer病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
1.2.4 BALF中IL-18、IL-1β水平測(cè)定:取1.2.3中的BALF 4℃下解凍,采用ELISA試劑盒測(cè)定BALF中IL-18、IL-1β水平,具體按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
1.2.5 肺組織中NLRP3、caspase-1表達(dá)水平的檢測(cè)
1.2.5.1 qRT-PCR檢測(cè)NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平,取約0.5 g 1.2.3中的凍存的肺組織剪碎,加入RNAiso Plus并參照其說(shuō)明書(shū)的步驟提取總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,以熒光定量PCR試劑盒后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系的配制、反應(yīng)條件的設(shè)定按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,以GADPH為內(nèi)參基因,qRT-PCR引物序列見(jiàn)表2,2-ΔΔCt算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。見(jiàn)表2。
表2 qRT-PCR引物序列
1.2.5.2 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平,取約0.5 g 1.2.3中的凍存的肺組織剪碎,加入預(yù)冷的蛋白裂解液(添加蛋白酶抑制劑)混勻,勻漿機(jī)制備為勻漿液, 3 000 r/min,4℃離心20 min,取上清液轉(zhuǎn)移至干凈的Ep管中,即為總蛋白,做好標(biāo)記,以BCA試劑盒測(cè)定5組樣品總蛋白濃度,根據(jù)結(jié)果5組分別取相同質(zhì)量的蛋白樣品,以電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE電泳,使用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移全部分離的蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride,PVDF)上,根據(jù)目的蛋白分子量截取蛋白條帶置于小盒中,室溫以5%的脫脂奶粉封閉2 h,分別加入相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜,TBST溶液漂洗3次,室溫孵育羊抗兔二抗2 h,TBST漂洗3次,以化學(xué)發(fā)光試劑顯色,Tanon軟件拍攝圖像并分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
2.1 5組大鼠肺功能比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠VT、Ri顯著升高(P<0.05),f、MV、PEF顯著降低(P<0.05);與模型組比較,清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠VT、Ri均降低(P<0.05),f、MV、PEF均升高(P<0.05);與清肺化痰顆粒組及VX-765組分別比較,清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠VT、Ri均降低(P<0.05),f、MV、PEF均升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。
表3 5組大鼠肺功能比較
2.2 5組大鼠肺組織損傷情況比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肺組織氣管黏膜水腫充血、肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,融合面積擴(kuò)大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等肺損傷癥狀,Holfbauer評(píng)分顯著升高(P<0.05);與模型組比較,清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠病理?yè)p傷癥狀減輕,Holfbauer評(píng)分均降低(P<0.05);與清肺化痰顆粒組及VX-765組分別比較,清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠病理?yè)p傷癥狀進(jìn)一步減輕,Holfbauer評(píng)分均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表4。
表4 5組大鼠肺組織Holfbauer評(píng)分 n=12,分,
2.3 5組大鼠BALF中IL-18、IL-1β比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平均降低(P<0.05);與清肺化痰顆粒組和VX-765組比較,清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平均降低(P<0.05)。見(jiàn)表5。
表5 5組大鼠BALF中IL-18、IL-1β比較
2.4 5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)均降低(P<0.05);與清肺化痰顆粒組和VX-765組比較,清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)均降低(P<0.05)。見(jiàn)表6。
表6 5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)
2.5 5組大鼠NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)均降低(P<0.05);與清肺化痰顆粒組和VX-765組比較,清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)均降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表7。
表7 5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)比較
圖2 免疫印跡檢測(cè)5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá);A 假手術(shù)組;B 模型組;C 清肺化痰顆粒(1 g/kg)組;D VX-765(50 mg/kg)組;E 清肺化痰顆粒+VX-765(劑量分別為1 g/kg,50 mg/kg)組
近年來(lái)COPD的發(fā)病率逐年上升,已成為世界范圍內(nèi)的主要慢性疾病,具有較高的致病率、死亡率,全球每年約600萬(wàn)人死于COPD,是疾病致死原因的第四位,預(yù)計(jì)到2020年,將成為全球第三大死亡原因[15]。當(dāng)其急性發(fā)作時(shí),患者肺組織氣管黏膜水腫充血、肺泡結(jié)構(gòu)大量被破壞并融合、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)呼吸道,大量分泌粘液,使患者呼吸困難,嚴(yán)重威脅患者身心健康、影響生活質(zhì)量,給患者家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),治療COPD成為當(dāng)前的臨床熱點(diǎn)之一,因此本研究具有重要的社會(huì)價(jià)值及臨床意義[16]。COPD的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,目前公認(rèn)最主要病因是吸煙,煙草燃燒產(chǎn)生的大量有毒物質(zhì)能夠促使肺組織中的巨噬細(xì)胞、呼吸系統(tǒng)上皮細(xì)胞釋放IL-18、IL-1β等炎性因子,使中性粒細(xì)胞透過(guò)肺泡毛細(xì)血管募集至肺部引起炎性反應(yīng),導(dǎo)致肺組織發(fā)生病理性改變,進(jìn)而造成大量組織損傷,促進(jìn)COPD發(fā)生發(fā)展[17]。本研究采用氣道滴注LPS溶液加煙熏的方法建立慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠模型;由結(jié)果可知,相比假手術(shù)組,模型組大鼠出現(xiàn)氣管黏膜水腫充血、肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,融合面積擴(kuò)大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等肺損傷癥狀, Holfbauer評(píng)分,肺功能指標(biāo)VT、Ri顯著升高,肺功能指標(biāo)f、MV、PEF顯著降低,表明模型大鼠肺部出現(xiàn)炎性反應(yīng),肺功能受損,模型制備成功。
研究表明,清肺化痰湯能有效治療急性加重期慢性阻塞性肺疾病,改善患者的臨床癥狀[18],但其藥理機(jī)制目前并不十分清楚,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NLRP3/caspase-1信號(hào)被激活時(shí),可促進(jìn)免疫細(xì)胞合成并分泌大量IL-1β、IL-18,作用于其受體IL-1R 及 IL-18R,觸發(fā)NF-κB依賴的一系列信號(hào),引起嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[19], 其還參與調(diào)節(jié)COPD的發(fā)生及疾病的進(jìn)展,急性加重期COPD患者肺組織中NALP3炎癥小體被激活,NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β表達(dá)相比穩(wěn)定期COPD患者顯著升高,穩(wěn)定期COPD患者NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β表達(dá)相比健康人顯著升高[20],推測(cè)下調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)可能是清肺化痰顆粒治療急性加重期慢性阻塞性肺疾病的藥理機(jī)制。本研究采用腹腔注射NLRP3炎性小體抑制劑VX-765處理慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠,結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)清肺化痰顆粒及VX-765處理的大鼠病理?yè)p傷癥狀均減輕,Holfbauer評(píng)分、肺功能指標(biāo)VT、Ri,BALF中IL-18及IL-1β水平,肺組織中NLRP3及caspase-1表達(dá)均降低,肺功能指標(biāo)f、MV、PEF均升高,表明下調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)和清肺化痰顆粒作用類似,均可減輕肺部炎性反應(yīng)、修復(fù)肺損傷,改善肺功能,揭示NLRP3/caspase-1信號(hào)是治療急性加重期COPD的靶點(diǎn),另外VX-765聯(lián)合清肺化痰顆粒,大鼠的病理?yè)p傷癥狀進(jìn)一步減輕,Holfbauer評(píng)分、肺功能指標(biāo)VT、Ri,BALF中IL-18及IL-1β水平,肺組織中NLRP3及caspase-1表達(dá)均更為降低,肺功能指標(biāo)f、MV、PEF均進(jìn)一步升高,表明清肺化痰顆粒和VX-765合用可協(xié)同下調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào),減輕肺部炎性反應(yīng),修復(fù)肺損傷,改善肺功能作用更強(qiáng),揭示NLRP3/caspase-1信號(hào)可能是清肺化痰顆粒治療急性加重期COPD的分子機(jī)制。
綜上所述,清肺化痰顆粒可減輕肺部炎性反應(yīng),修復(fù)肺損傷,改善肺功能,下調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)可能是其藥理機(jī)制,但本文未上調(diào)NLRP3/caspase-1信號(hào)進(jìn)行進(jìn)一步研究驗(yàn)證,存在一定的不足,還需后續(xù)的深入研究。