miR-300 通過負(fù)向調(diào)控垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1 抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的侵襲和轉(zhuǎn)移

梁 答，吳曉林，白 俊，張麗萍，尹崇高，鐘 偉

濰坊醫(yī)學(xué)院1附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外一科//矯形骨科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，3護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊261053

骨肉瘤目前仍是兒童和青少年惡性腫瘤死亡率很高的疾病，患者的5年生存率一直保持在60%～70%［1］。約18%的患者在臨床表現(xiàn)時(shí)可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)轉(zhuǎn)移發(fā)生在肺部［2］。早期轉(zhuǎn)移是骨肉瘤治療的難點(diǎn)。因此，有必要了解骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制，以制定有效的治療策略。

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1）是一種參與促進(jìn)中期姐妹染色單體分離的安全蛋白［3］，在有絲分裂過程中通過保護(hù)染色體穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用［4］。據(jù)報(bào)道，PTTG1除了具有保護(hù)蛋白功能外［5］，還有促進(jìn)惡性細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用［6］。PTTG1通過整合素局灶性粘附激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MMPs的改變直接參與肺癌細(xì)胞的侵襲［7］。PTTG1在人乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)［8］。然而，PTTG1是否能通過其他方式影響骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和增殖還有待于進(jìn)一步研究。

MiRNA通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解而充當(dāng)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)劑［9］。研究表明miRNA的異常表達(dá)與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)［10-12］。為了研究PTTG1影響骨肉瘤細(xì)胞侵襲和增殖的機(jī)制，我們通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站starbase 和miRmap 發(fā)現(xiàn)miR-300 和PTTG1可能結(jié)合。且在GEO數(shù)據(jù)集GSE28423中，我們發(fā)現(xiàn)與正常的骨組織相比miR-300在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)降低。MiR-300與PTTG1在骨肉瘤中相互作用未見有報(bào)道，因此我們選定miR-300繼續(xù)下一步研究。MiRNA作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，是生物標(biāo)志物開發(fā)的有希望的候選者。因此，充分了解miR-300在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用及其與PTTG1之間的關(guān)系至關(guān)重要。

1 材料和方法

1.1 材料

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green rea1-time PCR Master Mix（博日科技有限公司）；PTTG1、β-Actin抗體均（艾博抗貿(mào)易有限公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因載體、PTTG1敲減質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒、PTTG1過表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒、miR-300過表達(dá)及其對(duì)照質(zhì)粒由吉?jiǎng)P基因構(gòu)建；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系hFOB1.19、293T、MG63（ATCC）。

1.2 網(wǎng)上在線microRNA分析工具

用starBase、miRmap預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)可能與PTTG1互補(bǔ)結(jié)合的miRNA；NCBI 下載骨肉瘤中miRNA 表達(dá)的GEO數(shù)據(jù)集GSE28423。GSE28423數(shù)據(jù)集包含19個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系，4個(gè)正常骨組織的miRNA的表達(dá)情況，利用正常骨組織作為對(duì)照，進(jìn)行骨肉瘤細(xì)胞的差異miRNA表達(dá)分析。選定可以與PTTG1互補(bǔ)結(jié)合而且在骨肉瘤組織中表達(dá)降低的miR-300 為研究對(duì)象；在線預(yù)測(cè)miR-300 與PTTG1 存在的結(jié)合位點(diǎn)。利 用miRpath（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaToo1s/index.php）進(jìn)行miR-300 的信號(hào)相關(guān)通路篩選。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

hFOB1.19使用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，293T、MG63 使用含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。細(xì)胞轉(zhuǎn)染依照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作。PTTG1敲低對(duì)照質(zhì)粒序列由吉?jiǎng)P基因構(gòu)建合成，PTTG1 敲低序列5'-GACCCUGGAUGUUGAAUUG-3'。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后分組。MG63組：正常培養(yǎng)，不做任何處理；Scr/MG63組：轉(zhuǎn)入PTTG1敲低對(duì)照質(zhì)粒；SiPTTG1/MG63組：轉(zhuǎn)入PTTG1敲低質(zhì)粒；MG63/NC組：轉(zhuǎn)入miR-300過表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒；MG63/miR-300組：轉(zhuǎn)入miR-300過表達(dá)質(zhì)粒；MG63/miR-300+PTTG1組：共轉(zhuǎn)染miR-300過表達(dá)及PTTG1過表達(dá)質(zhì)粒。

1.4 qRT-PCR

RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)［13］。通過得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR。U6的上游引物為GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物為CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；miR-300上游引物：AGGGTATACAAGGGCAGACT，下游引物：GAGAGGAGAGGGAGAGGAGA，莖 環(huán) 結(jié) 構(gòu) ：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACAGTGTG；miR-300 表達(dá)使用U6 作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt分析的方法進(jìn)行分析。

1.5 Western b1ot檢測(cè)

將各組細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4 ℃過夜、TBST洗膜、二抗孵育、TBST洗膜、顯影、曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？贵w配制如下：β-Actin（1∶1 000）、PTTG1（1∶500）。

1.6 Transwe11 侵襲實(shí)驗(yàn)

制備含有基質(zhì)膠的Transwe11小室，細(xì)胞接種后培養(yǎng)48 h，用棉簽取出內(nèi)側(cè)未侵入的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定，吉姆薩試劑染色，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取均值作為最終結(jié)果。

1.7 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

制備細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔約100 μL、2×103細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后每孔加入含10%CCK8的培養(yǎng)基10 μL。分別測(cè)定轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后的細(xì)胞吸光度值A(chǔ)450nm，計(jì)算結(jié)果。

1.8 雙熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將miR-300 過表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒分別與PTTG1的3'UTR野生型（pGL3-PTTG1 3'UTR-WT）報(bào)告載體和突變型（pGL3-PTTG1 3'UTR-MUT）報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染報(bào)告載體48 h，吸取培養(yǎng)基上清，再用PBS洗滌細(xì)胞；向培養(yǎng)孔中加入PLB裂解液，裂解15 min；收集裂解液并進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定，以螢火蟲熒光素酶活性值與海腎熒光素酶活性值的比值作為相對(duì)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTTG1在骨肉瘤細(xì)胞MG63中高表達(dá)以及PTTG1在骨肉瘤細(xì)胞中敲減成功

用Western b1ot檢測(cè)人成骨細(xì)胞hFOB1.19及骨肉瘤細(xì)胞MG63中PTTG1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PTTG1在骨肉瘤細(xì)胞MG63中表達(dá)（1.53±0.08）較高，在人成骨細(xì)胞hFOB1.19中表達(dá)（1.00±0.07）較低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0002，圖1A）。RNA 干擾技術(shù)敲低PTTG1后，通過Western b1ot檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞MG63中PTTG1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Scr/MG63組（1.00±0.10）相比，PTTG1在SiPTTG1/MG63組中表達(dá)（0.40±0.06）明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0007，圖1B）。

圖1 PTTG1在骨肉瘤細(xì)胞MG63中高表達(dá)以及PTTG1在骨肉瘤細(xì)胞中敲減成功Fig.1 Detection of PTTG1 expression of in MG63 cells and PTTG1 was successfully knocked down in osteosarcoma cells. A: PTTG1 expression was higher in MG63 cells and lower in hFOB1.19 cells, *P＜0.05 vs hFOB1.19 group. B: After the knockdown of PTTG1, the expression of PTTG1 in MG63 cell was significantly reduced,*P＜0.05 vs Scr/MG63 group.

2.2 敲低PTTG1后，骨肉瘤細(xì)胞MG63的體外侵襲和增殖能力下降

敲低PTTG1后，Transwe11侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組穿過下室的細(xì)胞數(shù)量（466.67±18.80）相比，敲低PTTG1組的穿過下室的細(xì)胞數(shù)量（267.00±9.09）明顯降低（圖2A、B）。運(yùn)用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組在72 h、96 h（72 h：0.66±0.04，96 h：0.95±0.03）的增殖能力相比，敲低PTTG1 組在72 h、96 h（72 h：0.44±0.04，96 h：0.67±0.06）的增殖能力明顯降低（圖2C）。

2.3 miR-300是PTTG1的靶基因

網(wǎng)上預(yù)測(cè)軟件starBase 與miRmap 預(yù)測(cè)可能與PTTG1 互補(bǔ)結(jié)合的miRNA，NCBI 下載骨肉瘤中miRNA 表達(dá)的GEO 數(shù)據(jù)集GSE28423 并篩選出1og2FC＜-1、P＜0.05的miRNA，三者取交集，分析選定可以與PTTG1互補(bǔ)結(jié)合而且在骨肉瘤組織中表達(dá)降低的miR-300為研究對(duì)象（圖3A、B）。qRT-PCR檢測(cè)人成骨細(xì)胞hFOB1.19及骨肉瘤細(xì)胞MG63中miR-300的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-300在骨肉瘤細(xì)胞MG63中表達(dá)（0.48±0.06）較低，在人成骨細(xì)胞hFOB1.19中表達(dá)（1.00±0.06）較高（P=0.0004，圖3C）。轉(zhuǎn)染miR-300過表達(dá)質(zhì)粒后，qRT-PCR檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞MG63中miR-300的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與MG63/NC組（1.00±0.10）相比，MG63/miR-300組miR-300的表達(dá)（2.30±0.12）明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，圖3D）。

2.4 miR-300在多種癌相關(guān)信號(hào)通路富集并且和PTTG1靶向結(jié)合

KEGG 通路富集分析表明miR-300 主要富集于Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等多種癌相關(guān)信號(hào)通路（圖4A）。轉(zhuǎn)染miR-300過表達(dá)質(zhì)粒后，Western b1ot檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞MG63中PTTG1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與MG63/NC 組（1.00±0.10）相比，PTTG1 在MG63/miR-300組中的表達(dá)（0.48±0.08）明顯降低（P=0.0007，圖4B）。在線預(yù)測(cè)miR-300與PTTG1存在的結(jié)合位點(diǎn)，采用雙熒光素酶檢測(cè)miR-300能否與PTTG1靶向結(jié)合。結(jié)果顯示，miR-300過表達(dá)質(zhì)粒與pGL3-PTTG1 3'-UTR-WT報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低。miR-300與PTTG1 mRNA的3'UTR可靶向結(jié)合（圖4C）。

圖2 敲低PTTG1抑制MG63細(xì)胞的體外侵襲和增殖能力Fig.2 Knockdown of PTTG1 inhibits invasion and proliferation of MG63 cells.A,B:Invasion of transfected PTTG1 knockdown control group and knockdown group were determined by Transwell,Giemsa staining,scale bar=100 μm,Mean±SD,n=3,*P＜0.05 vs Scr/MG63 group;C:CCK8 assay detected the proliferation ability of each group,*P＜0.05 vs Scr/MG63 group.

圖3 miR-300是PTTG1的靶基因Fig.3 MiR-300 is the target gene of PTTG1.A:Venny plot of predicted genes;B:Expression of miR-300 in OS cell line and Human Bone tissue;C:Expression of miR-300 in hFOB1.19 and MG63 cells;D:Transfection efficiency of miR-300 in MG63 cells.*P＜0.05.

2.5 miR-300靶向調(diào)控PTTG1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63體外侵襲和增殖能力

圖4 miR-300與PTTG1靶向結(jié)合Fig.4 Targeted binding of MiR-300 to PTTG1.A:KEGG analysis of miR-300;B:After overexpression of miR-300,PTTG1 expression in MG63 cells was low;C:The binding sites of miR-300 and PTTG1.*P＜0.05.

Transwe11 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-300 質(zhì)粒（126.00±17.57）相比，共轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-300和過表達(dá)PTTG1質(zhì)粒后，骨肉瘤細(xì)胞MG63的穿膜細(xì)胞數(shù)（320.00±12.47）明顯增多（P=0.0003，圖5A、B）。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-300（48 h：0.37±0.03；72 h：0.43±0.02；96 h：0.55±0.02）相比，共轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-300和過表達(dá)PTTG1質(zhì)粒后，骨肉瘤細(xì)胞MG63 的增殖能力（48 h：0.48±0.02；72 h：0.66±0.04；96 h：0.79±0.06）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0077，圖5C）。

3 討論

骨肉瘤是一種來源于間充質(zhì)組織的惡性骨腫瘤［14］。盡管骨肉瘤的治療方法有手術(shù)切除，輔助化療和放療，但是對(duì)于轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性疾病的患者生存率仍然低于20%［15-16］。因此，研究骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，控制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，有助于提高患者生存率，對(duì)骨肉瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等具有重要的臨床意義［17］。

人類PTTG 家族至少含有3 種同源蛋白PTTG1、PTTG2和PTTG3，其中PTTG1已被詳細(xì)研究［18］。PTTG1是一種多功能蛋白，在控制有絲分裂、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、DNA修復(fù)和胎兒發(fā)育等方面發(fā)揮作用［19］。最重要的是，PTTG1在大多數(shù)正常組織中的表達(dá)受到限制。相反，它在各種內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤中大量表達(dá)，例如垂體、乳腺腫瘤和甲狀腺，以及非內(nèi)分泌相關(guān)的癌癥，包括消化、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)［20,1］。本研究通過Western b1ot、Transwe11侵襲和CCK8實(shí)驗(yàn)得出，PTTG1基因可以促進(jìn)MG63的侵襲和增殖能力，使得腫瘤細(xì)胞的自我更新和分化能力增強(qiáng)。前期研究發(fā)現(xiàn)通過抑制PTTG1的表達(dá)能夠抑制骨肉瘤的發(fā)展［21］，與本研究得出的結(jié)論一致。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的發(fā)展中起著重要的作用［22］。例如：miR-26a、miR-29b、miR-155-5p、miR-148a-3p 等miRNA 在調(diào)節(jié)骨肉瘤進(jìn)展中具有重要作用［23-25］；本研究還證明了miR-300可與PTTG1靶向結(jié)合，進(jìn)而對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移和增殖能力產(chǎn)生影響。而且有研究發(fā)現(xiàn)miR-300表達(dá)水平的改變與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，miR-300能夠通過靶向cu11in 4B 抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展［26］；miR-300 可通過靶向Twist抑制頭，頸鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌細(xì)胞的上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移［27］；miR-300能夠通過靶向ROS1抑制肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲［28］，表明miR-300具有在多種腫瘤中均具有抑制作用［29］。本研究可以作為miR-300在腫瘤中發(fā)揮作用的一個(gè)有效補(bǔ)充。

綜上所述，本研究證實(shí)，miR-300 通過負(fù)向調(diào)控PTTG1 影響骨肉瘤細(xì)胞MG63 的侵襲，轉(zhuǎn)移和增殖。我們的研究結(jié)果為骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的見解，為臨床提供了可能治療骨肉瘤的新靶點(diǎn)。

圖5 miR-300靶向調(diào)控PTTG1并抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63體外侵襲和增殖能力Fig.5 miR-300 targets PTTG1 and inhibits the invasion and proliferation of MG63 cells.A,B:Invasion ability in different transfected cells,Giemsa staining,scale bar=100 μm,Mean±SD,n=3;C:CCK8 assay for detecting the proliferation and statistical analysis of each group.*P＜0.05.