尼克酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶在肺腺癌間質(zhì)中的表達(dá)及其生物學(xué)功能

鞠薇薇，于生金，林黎娟，邵志翔，張奇芳，江黎黎△

肺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下［1］。尋找肺癌早期標(biāo)志物以及預(yù)后指標(biāo)將有助于早期診斷，并為治療提供新思路。尼克酰胺-N- 甲基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide Nmethyltransferase，NNMT）是人體內(nèi)重要的甲基化酶，可以催化尼克酰胺和其他吡啶衍生物的甲基化，并參與多種化合物的生物轉(zhuǎn)化［2］。正常人體內(nèi)NNMT 主要在肝臟內(nèi)表達(dá)，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)NNMT 在皮膚腫瘤［3］、膠質(zhì)瘤［4］、胰腺癌［5］、胃癌［6］和腸癌［7］等多種腫瘤組織中異常表達(dá)。上述研究?jī)H關(guān)注了NNMT在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和功能。最近有文獻(xiàn)報(bào)道了卵巢癌間質(zhì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancerassociated fibroblasts，CAF）中的NNMT 可以顯著促進(jìn)卵巢癌的惡性進(jìn)展［8］。NNMT 在其他腫瘤間質(zhì)中是否也有表達(dá)及相似功能尚不明了。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討肺腺癌間質(zhì)細(xì)胞中NNMT的表達(dá)與腫瘤惡性進(jìn)展及患者預(yù)后的關(guān)系，以期為深入研究NNMT在肺腺癌中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和思路。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 搜集丹東市第一醫(yī)院2010年1月—2013年12 月收治的150 例肺腺癌患者手術(shù)切除的組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者術(shù)前均未經(jīng)放化療及其他治療。（2）手術(shù)后組織病理結(jié)果為肺腺癌?；颊吣挲g38～86歲，中位年齡60歲；男89 例，女61 例；TNM 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期105 例，Ⅲ～Ⅳ期45例。本研究得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且所有患者均簽署知情同意書。對(duì)納入患者采用電話、查閱病歷和寫信等方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019 年6 月，隨訪時(shí)間4～96 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間77個(gè)月，隨訪信息完整者共101例。

1.2 細(xì)胞及試劑 人肺成纖維細(xì)胞HLF-1及肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和PC9 購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），兔抗人NNMT多克隆抗體（ab223513）、內(nèi)參β-actin抗體（ab8226）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，免疫組化專用一抗稀釋液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記通用二抗（PV-6000）及DAB 顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用胎牛血清和培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。過(guò)表達(dá)NNMT 質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒及慢病毒載體委托上海吉?jiǎng)P基因公司合成并包被。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，SYBR Green PCR 試劑購(gòu)自日本TaKaRa 公司。Alexa fluo594（A-11012）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；CCK-8 試劑盒、RIPA 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色檢測(cè)腺癌組織中NNMT 表達(dá) 染色采用SP二步法，組織切片常規(guī)脫蠟水化，高壓修復(fù)暴露抗原，雙氧水孵育去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，兔抗人NNMT 一抗（1∶200）4 ℃孵育過(guò)夜，免疫組化通用二抗室溫孵育1 h，DAB 顯色2 min。免疫組化結(jié)果判斷：綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性強(qiáng)度，采用半定量方法，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例［0 分（0%），1 分（1%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%）及4 分（76%～100%）］和著色強(qiáng)度［0分（無(wú)著色），1分（淡黃色），2分（棕黃色）及3分（棕褐色）］，將2個(gè)分值相乘，每張切片于熱點(diǎn)區(qū)域隨機(jī)讀取10個(gè)高倍視野，對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)分別進(jìn)行評(píng)分。最后按評(píng)分結(jié)果將所有病例標(biāo)本劃分為2組，0～4分為低表達(dá)組，5～12分為高表達(dá)組。

1.4 穩(wěn)定表達(dá)NNMT 細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定 人肺成纖維細(xì)胞HLF-1 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)設(shè)過(guò)表達(dá)NNMT 質(zhì)粒（NNMT組）和對(duì)照質(zhì)粒（control組）。提前24 h將HLF-1細(xì)胞接種至6孔板，按照感染復(fù)數(shù)計(jì)算所需病毒量，然后將NNMT過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒分別感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLF細(xì)胞；48 h后用1 mg/L 嘌呤霉素篩選細(xì)胞，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)NNMT 的HLF-1細(xì)胞。

1.4.1 熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)HLF-1 中NNMT 的mRNA表達(dá) 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的過(guò)表達(dá)NNMT 組和control 組HLF-1細(xì)胞，TRIzol 法提取RNA 并用凝膠電泳對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。使用Power SYBR Green 進(jìn)行qPCR，以GAPDH 為內(nèi)參。NNMT 上游引物5'-AGGAACCAGGAGCCTTTGACT-3'，下游引物5'-CCTGAGGGCAGTGCGATAGG-3'；GAPDH 上游引物5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' ，下 游 引 物 5'-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'。按照PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)HLF-1 細(xì)胞中NNMT 蛋白表達(dá)水平 將2組細(xì)胞接種至細(xì)胞爬片，24 h后取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.2%Triton X-100室溫破膜10 min，封閉液室溫封閉1 h，一抗（1∶100 稀釋）4 ℃過(guò)夜，二抗Alexa fluo594（1∶200）室溫下反應(yīng)1 h，DAPI核染色，封片。在激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.4.3 Western blot 檢測(cè)HLF-1 細(xì)胞中NNMT 蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2 組細(xì)胞（約2×106個(gè)），RIPA 裂解液提取蛋白，BCA 法測(cè)量蛋白濃度后上樣（50 μg），10% SDSPAGE 90 min，250 mA轉(zhuǎn)膜2 h濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移于PVDF膜上，切取含目的條帶的PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。NNMT（1∶2 000）與β-actin（1∶5 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜后ECL顯影。采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞共培養(yǎng) NNMT組及control組HLF-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液至50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，吸取上清作為培養(yǎng)基加入A549和PC9細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.5.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取共培養(yǎng)后的A549和PC9 細(xì)胞，接種于96 孔板中（2.5×104/mL），各組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，然后分別在培養(yǎng)24、48、72、96及120 h棄去原有培養(yǎng)液，加入含10%CCK-8 的培養(yǎng)液100 μL，孵育2 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)各孔490 nm處的光密度（OD）值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取共培養(yǎng)后的A549 和PC9 細(xì)胞，1 000 個(gè)/孔接種于6 孔板中，靜置培養(yǎng)10～14 d，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，棄去上清液，加入甲醇于-20 ℃冰箱中固定克隆6 min，0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色30 min。在光學(xué)顯微鏡（400倍）下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.5.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549和PC9細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，離心后用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，在小室的上室中加入約10 000 個(gè)細(xì)胞，在24孔板中加入500 μL穩(wěn)定表達(dá)NNMT的肺成纖維細(xì)胞系及control 組細(xì)胞24 h的培養(yǎng)液，將小室放在24孔板中；培養(yǎng)24 h 后，棉簽擦拭上室中未穿過(guò)小室膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下采集圖像，40 倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)讀取10 個(gè)視野，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 和PC9 細(xì)胞，5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中。24 h 后用20 μL移液器槍頭在細(xì)胞表面劃痕，PBS清洗脫落細(xì)胞，加入穩(wěn)定表達(dá)NNMT 的肺成纖維細(xì)胞系及control 組細(xì)胞24 h 的培養(yǎng)液，于24 h 在光學(xué)顯微鏡下測(cè)量劃痕寬度并拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率，遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法繪制不同NNMT 表達(dá)情況肺腺癌患者的生存曲線，Log-rank 檢驗(yàn)比較生存率的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Fig.1 NNMT expression in lung adenocarcinoma(DAB staining,×400)圖1 NNMT在肺腺癌組織中的表達(dá)（DAB顯色，×400）

Fig.2 The survival curves of patients with high and low NNMT expressions in lung adenocarcinoma圖2 肺腺癌中NNMT高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存曲線

2.1 NNMT在肺癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后及臨床病理特征關(guān)系 免疫組化染色結(jié)果顯示，NNMT 在肺腺癌癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，且主要定位在細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。經(jīng)半定量分析后，150例患者中65例癌細(xì)胞中NNMT高表達(dá)，83例間質(zhì)細(xì)胞中NNMT高表達(dá)。生存分析結(jié)果見(jiàn)圖2，癌細(xì)胞中高表達(dá)與低表達(dá)NNMT患者的總生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=2.625，P＞0.05），而腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)NNMT患者的總生存率明顯低于低表達(dá)者（Log-rankχ2=9.685，P＜0.01），預(yù)后較差。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中NNMT高表達(dá)比例較高；同時(shí)病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者腫瘤細(xì)胞中NNMT 高表達(dá)比例較高，其他不同臨床病理特征間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of the expression levels of NNMT in tumor stromal cells and tumor cells of lung adenocarcinoma between patients with different clinicopathological features表1 不同臨床病理特征的肺腺癌患者的腫瘤間質(zhì)及腫瘤細(xì)胞NNMT表達(dá)水平比較 例（%）

2.2 成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NNMT 的HFL-1 細(xì)胞 Western blot（圖3A）、qPCR（圖3B）、細(xì)胞免疫熒光染色（圖3C）結(jié)果均顯示，NNMT 組NNMT 的表達(dá)水平均高于control組。

2.3 肺成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NNMT 對(duì)肺癌細(xì)胞遷移的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，NNMT組的HFL-1的培養(yǎng)液均可促進(jìn)A549 和PC9 細(xì)胞的遷移和侵襲。見(jiàn)表2、圖4。

Fig.3 Identification of stable NNMT expression in HFL-1 cells圖3 HFL-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)NNMT的鑒定結(jié)果

Tab.2 Comparison of cell mobility and invasion number between control group and NNMT group表2 Control組和NNMT組細(xì)胞遷移率和侵襲數(shù)量比較（n=3，x±s）

2.4 HFL-1 的培養(yǎng)液對(duì)A549 和PC9 增殖及克隆的影響 HFL-1 培養(yǎng)液與肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與control 組相比，NNMT 組A549 和PC9 細(xì)胞增殖速度自2 d 起均顯著加快（圖5A），細(xì)胞克隆的形成能力明顯提高［A549 細(xì)胞：（93.00±13.45）個(gè)/視野vs.（56.67±4.16）個(gè)/視野，t=4.469，P＜0.01；PC9 細(xì)胞：（160.70±11.02）個(gè)/視野vs.（91.67±9.67）個(gè)/視野，t=7.465，P＜0.01］，見(jiàn)圖5B。

Fig.4 Changes of lung cancer cell migration and invasion ability in control group and NNMT group圖4 對(duì)照組和NNMT組肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力變化

Fig.5 Changes of proliferation and clone formation of lung cancer cells in control group and NNMT group圖5 對(duì)照組和NNMT組肺癌細(xì)胞增殖及克隆形成數(shù)量變化

3 討論

近年來(lái)，肺癌的手術(shù)治療、輔助化療以及靶向治療均取得了較大的進(jìn)展，但肺癌5 年生存率依然很低。因此，尋求新的治療靶點(diǎn)及預(yù)后指標(biāo)能夠?yàn)榉伟┲委熖峁┬滤悸?。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)肺腺癌間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)NNMT 提示患者不良預(yù)后，而且CAF的條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

NNMT 是N-甲基轉(zhuǎn)移酶家族的一種胞質(zhì)酶，可以通過(guò)消耗甲基供體和產(chǎn)生活性代謝物參與調(diào)節(jié)脂肪、肝臟等組織代謝；NNMT的活性升高可有效降低細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡［9］。研究發(fā)現(xiàn)NNMT 在多種癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，而且NNMT的上調(diào)參與了多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，NNMT 可能是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物［10-11］。Tomida等［12］發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中NNMT水平顯著高于健康人群，且比常用的血清指標(biāo)癌胚抗原（CEA）更加敏感。另有研究發(fā)現(xiàn)NNMT在肺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，在肺癌細(xì)胞中敲減NNMT后，細(xì)胞的增殖和克隆形成能力均受到抑制［13］。另外，NNMT在非小細(xì)胞肺癌對(duì)靶向藥物耐藥過(guò)程中也起著重要的作用［14］。然而，關(guān)于NNMT 促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機(jī)制仍不清楚。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用，CAF 作為腫瘤微環(huán)境中最主要的細(xì)胞成分之一，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，敲減CAF 細(xì)胞中的NNMT 后，細(xì)胞內(nèi)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的組蛋白的甲基化修飾顯著增加，進(jìn)而調(diào)控多種基因的表達(dá)，其中包括多種癌基因［8］。但目前尚不清楚NNMT在肺癌間質(zhì)中是否發(fā)揮著相似的促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的功能。本研究在人成纖維細(xì)胞系HFL-1中過(guò)表達(dá)NNMT，然后收集過(guò)表達(dá)NNMT 細(xì)胞和control 組細(xì)胞的培養(yǎng)液，用以上2 種培養(yǎng)液培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞A549 和PC9，比較2 組培養(yǎng)液對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于過(guò)表達(dá)NNMT組的培養(yǎng)液可以顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和克隆的形成，而且對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力也有顯著的促進(jìn)作用，提示CAF 的條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。NNMT作為一種活躍的代謝酶，是通過(guò)影響間質(zhì)細(xì)胞的代謝進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞，還是通過(guò)外泌體等途徑將間質(zhì)細(xì)胞的NNMT 直接轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞中，其中涉及的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí)本研究免疫組化結(jié)果顯示，NNMT 在肺腺癌的癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。其中，腫瘤間質(zhì)中NNMT 的蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，而且腫瘤間質(zhì)中的高表達(dá)NNMT 的患者總生存率明顯下降，提示肺癌間質(zhì)中的NNMT可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

綜上，肺腺癌間質(zhì)中的NNMT 在肺癌惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用，有可能成為腫瘤靶向生物治療的潛在靶點(diǎn)。