葉黃素通過SIRT1/NLRP3信號(hào)通路提高人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞存活率的機(jī)制研究

萬芳，馬利方

糖尿病是一種與糖代謝異常相關(guān)的嚴(yán)重代謝綜合征，可引起血管、心臟、神經(jīng)、眼、肝臟和腎臟等多種組織和器官的慢性損傷和功能障礙。其中，糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）和黃斑病變是糖尿病的微血管并發(fā)癥，可致視力永久性受損乃至失明［1］。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelial cells，RPECs）在視網(wǎng)膜中具有許多重要的功能，包括光感受器外段的吞噬作用、類視黃醇的異構(gòu)化以及各種代謝和神經(jīng)營養(yǎng)支持功能［2］，并與視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)。血糖過高是DR 發(fā)病的關(guān)鍵因素。研究表明，高糖可誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子過度生成，同時(shí)可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)［3-5］。葉黃素，又稱植物黃體素，是一種類胡蘿卜素，在蔬菜、水果、花卉等植物中廣泛存在［6］，也是存在于人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的主要色素［7］。葉黃素具有防止光氧化和光破壞的保護(hù)作用，被認(rèn)為是一種有效的抗氧化劑。據(jù)報(bào)道，葉黃素具有多種藥理特性，包括抗氧化［8-9］、抗炎［10］和抗癌［11-12］等。此外，葉黃素還能通過調(diào)節(jié)抗氧化活性等信號(hào)通路來預(yù)防因衰老誘發(fā)的視網(wǎng)膜功能下降［13］，但目前尚不清楚葉黃素是否對(duì)DR 起治療作用。本研究以RPECs 為研究對(duì)象，旨在探討葉黃素對(duì)高濃度葡萄糖環(huán)境中RPECs的潛在影響，包括炎癥因子的表達(dá)、ROS的產(chǎn)生及其分子機(jī)制，為葉黃素治療DR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19 購于武漢普諾賽生命科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Thermo公司，C22400500BT），胎牛血清（FBS，以色列BI 公司，04-001-1-A），葉黃素（美國Sigma 公司，07168），CCK-8 試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，BA00208），RNA 提取試劑盒（美國Thermo 公司，12183020），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒（武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司，DN001），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（ab181421）、白細(xì)胞介素（IL）-1β ELISA試劑盒（ab100562）、IL-6 ELISA試劑盒（ab46027）、IL-18 ELISA 試劑盒（ab215539）均購自英國Abcam 公司，5-（和-6）-氯甲基-2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（CMH2DCFDA）探針（美國Sigma公司，D6883）。CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司，MCO-15AC），倒置顯微鏡（CX41）、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），核酸蛋白檢測儀、qPCR儀（美國Thermo 公司），SDS-PAGE 微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國BIO-RAD 公司），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-5200），低溫高速離心機(jī)（德國Sartorius公司，3k30），Multiskan酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 為確定葡萄糖對(duì)RPECs 活性的影響及處理?xiàng)l件，在ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖，即15、30、60、90 mmol/L 葡萄糖組，并設(shè)對(duì)照組（未添加葡萄糖），最終確定在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的葡萄糖處理組被命名為葡萄糖組；為確定葉黃素對(duì)RPECs 活性的影響及處理?xiàng)l件，在葡萄糖組ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同濃度的葉黃素，即5、10、20 μmol/L 葉黃素組、葡萄糖組（未添加葉黃素）和對(duì)照組（未添加葉黃素和葡萄糖），最終確定在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的葉黃素處理組被命名為葉黃素組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) ARPE-19 細(xì)胞復(fù)蘇后，使用添加10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和增濕、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約1～2 d換液1次，細(xì)胞生長融合至85%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基終止消化后，以1∶3 比例傳代，取對(duì)數(shù)生長期的4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，將ARPE-19 細(xì)胞在37 ℃、1%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性 在96孔板中接種ARPE-19 細(xì)胞懸液（每孔100 μL，約5 000 個(gè)細(xì)胞），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后，向各孔中加入10 μL 不同濃度的葡萄糖溶液、葉黃素溶液，并設(shè)置空白對(duì)照組，每組設(shè)4 個(gè)平行復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱孵育48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，加液過程中避免產(chǎn)生氣泡。培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度（A）值。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率（%）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（對(duì)照）-A（空白）］×100%。

1.2.4 ELISA 檢測炎性細(xì)胞因子水平 將ARPE-19 細(xì)胞以（1.0～1.5）×104個(gè)/mL 的密度接種在96 孔板中，并在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，收集培養(yǎng)基，使用ELISA試劑盒，根據(jù)說明書對(duì)培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-18 和IL-6 的含量進(jìn)行測量。

1.2.5 CM-H2DCFDA 探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平 在用細(xì)胞滲透性CM-H2DCFDA 孵育ARPE-19 細(xì)胞后，檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平。檢測原理為：在ROS 存在的條件下，CMH2DCFDA 將轉(zhuǎn)化為2’，7’-二氯熒光素（DCF）。將細(xì)胞以（1.0～1.5）×107個(gè)/mL 的密度接種在6 孔板中。30 mmol/L 葡萄糖或24.4 mmol/L 甘露醇處理細(xì)胞12 h 后，添加10 μmol/L CM-H2DCFDA 和1 μg/L DAPI，在不含F(xiàn)BS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 min。使用添加10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基清洗細(xì)胞后，用激光掃描共焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。在6個(gè)隨機(jī)視野中測量熒光強(qiáng)度，并使用Image J 1.41進(jìn)行分析。

1.2.6 qPCR檢測mRNA水平 收集各組ARPE-19細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并使用核酸蛋白檢測儀測定RNA的質(zhì)量和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA合成為cDNA后，分別使用SIRT1與NLRP3的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×Green Mix 10 μL，去離子水7 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：94 ℃2 min；94 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃10 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用相對(duì)定量2-ΔΔCt法計(jì)算各組ARPE-19細(xì)胞中SIRT1與NLRP3的相對(duì)表達(dá)水平。SIRT1引物：上游5'-GGAGCAGATTAGTAGGCGGC-3'；下游5'-CCTCAGCGCCATGGAAAATG-3'，產(chǎn)物大小80 bp。NLRP3引物：上 游5'-GGCAACACTCTCGGAGACAA-3' ；下 游5'-GGAAAGATCCCAGCAGCAGT-3'，產(chǎn)物大小126 bp。GAPDH引物：上 游5'-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3' ；下 游5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'，產(chǎn)物大小146 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 6.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均為4 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-Kramer檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖誘導(dǎo)對(duì)ARPE-19 細(xì)胞增殖活性的影響 15、30、60、90 mmol/L 葡萄糖組和對(duì)照組ARPE-19 細(xì) 胞 存 活 率 分 別 為（92.10±3.60）% 、（69.06±1.83）%、（44.22±0.73）%、（42.18±0.68）%和（96.20±2.39）%，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=566.072，P＜0.01）。15 mmol/L葡萄糖組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而30、60 與90 mmol/L 葡萄糖組較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。選取30 mmol/L葡萄糖作為高糖實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 高濃度葡萄糖對(duì)ARPE-19細(xì)胞炎癥因子、ROS水平及細(xì)胞存活率的影響 葡萄糖組IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 和ROS 水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而細(xì)胞存活率低于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of inflammatory factors,ROS levels and cell viability between glucose treatment group and control group表1 對(duì)照組與葡萄糖組炎癥因子、ROS水平及細(xì)胞存活率的比較 （n=4，x±s）

2.3 葉黃素對(duì)ARPE-19細(xì)胞炎癥因子、ROS水平的影響 與葡萄糧組相比，5 μmol/L 的葉黃素處理無法改善細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平和ROS 水平（P＞0.05）。10 μmol/L葉黃素組與葡萄糖組相比較，僅細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平顯著降低（P＜0.05）。20 μmol/L 葉黃素組較葡萄糖組IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 和ROS 水平均顯著降低（P＜0.05），見表2。選取20 mmol/L葉黃素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

2.4 葉黃素對(duì)ARPE-19 細(xì)胞SIRT1/NLRP3 信號(hào)通路和細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組相比，葡萄糖組細(xì)胞中的NLRP3mRNA 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），而SIRT1mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與葡萄糖組比較，葉黃素組SIRT1mRNA 表達(dá)水平和細(xì)胞存活率顯著上調(diào)，而NLRP3mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），見表3。

Tab.2 Comparison of inflammatory factors and ROS levels between the five groups表2 各組中炎癥因子和ROS水平的比較（n=4，x±s）

Tab.3 Comparison of SIRT1,NLRP3 mRNA and cell viability between the three groups表3 各組中SIRT1、NLRP3 mRNA和細(xì)胞存活率的比較（n=4，x±s）

3 討論

3.1 高濃度葡萄糖促進(jìn)RPECs 炎癥因子產(chǎn)生 DR已經(jīng)成為糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，其中RPECs功能障礙被認(rèn)為與DR的發(fā)病密切相關(guān)［14-15］。其病理機(jī)制可能是高血糖誘發(fā)視網(wǎng)膜炎癥和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致RPECs 活性顯著降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［16-17］。DR 患者普遍存在炎性細(xì)胞因子水平顯著增加的情況［18］。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的葡萄糖會(huì)增加RPECs中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［19-20］。與上述報(bào)道一致，本研究結(jié)果表明，高糖處理人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19 可以誘導(dǎo)細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18分泌顯著增加。

3.2 氧化應(yīng)激調(diào)控炎癥反應(yīng) 過氧化應(yīng)激是炎癥反應(yīng)的重要誘發(fā)因素。在人類多種炎癥疾病中均可以觀察到高水平的ROS 生成，細(xì)胞處于過氧化應(yīng)激狀態(tài)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。糖尿病時(shí)高血糖狀態(tài)下的多種合并癥，包括糖尿病足，神經(jīng)、腎、骨骼、心血管等系統(tǒng)的并發(fā)癥均與過氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［21-23］。本研究顯示，高血糖誘導(dǎo)RPECs 過氧化應(yīng)激與炎性細(xì)胞因子表達(dá)顯著增高，與既往在糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的研究結(jié)果一致［24］。

SIRT1是Sirtuin家族成員之一，可以通過調(diào)控線粒體的生物合成等調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平［25］。而NLRP3是炎癥小體家族成員，可以通過激活促炎性細(xì)胞因子IL-1β 等誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡［26］。SIRT1在多個(gè)組織中被證明可以負(fù)調(diào)控NLRP3［27-28］，但是兩者在RPECs 中的關(guān)系還未被揭示。本研究結(jié)果表明，SIRT1可以抑制NLRP3的激活，從而改善高糖環(huán)境中RPECs的活性。

3.3 葉黃素提高RPECs活性 有證據(jù)表明，葉黃素對(duì)人體健康尤其是眼的健康具有多種有益作用［29］。葉黃素可以預(yù)防和改善與年齡有關(guān)的黃斑疾病。本研究表明，葉黃素可以通過激活SIRT1降低氧化應(yīng)激水平，下調(diào)NLRP3表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子，改善RPECs活性。盡管當(dāng)前研究僅在細(xì)胞水平上證明了葉黃素對(duì)高糖環(huán)境中RPECs 活性的改善作用，但是既往已經(jīng)有小鼠或大鼠模型研究證明，補(bǔ)充葉黃素可顯著改善視網(wǎng)膜的血運(yùn)重建，提高視力，并對(duì)光損傷有明顯保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是淬滅氧自由基以及抑制脂質(zhì)的過氧化［30-32］，這與體外細(xì)胞水平研究結(jié)果一致。

綜上所述，高濃度葡萄糖在RPECs 中通過激活過氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)降低RPECs 活性，葉黃素可以通過SIRT1/NLRP3通路改善細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與炎性細(xì)胞因子水平，提高高糖環(huán)境RPECs活性，本研究結(jié)果為DR提供了一種潛在治療策略。