不同來(lái)源雞傳染性支氣管炎病毒M41株病毒特性的分析比較

張喜美　梁賢　劉曉倩　鄭叢叢　于春梅　王飛　胡曉明

摘? 要：為了比較2株不同來(lái)源的雞傳染性支氣管炎病毒（M41）毒株的生物學(xué)特性、免疫原性及S1基因同源性。將TONG-IBV和MOU-IBV分別接種10日齡SPF雞胚，觀察雞胚病變特點(diǎn)、計(jì)算病毒含量（EID50）、制備滅活疫苗進(jìn)行免疫抗體效價(jià)檢測(cè)，進(jìn)行S1基因測(cè)序分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：接種TONG-IBV株后雞胚出血較嚴(yán)重，蜷縮程度較輕，接種MOU-IBV的雞胚呈典型的蜷縮狀;MOU-IBV組抗體效價(jià)高于TONG-IBV組抗體效價(jià);同源性分析結(jié)果顯示，MOU株S1與M41參考株S1（GenBank序列號(hào)MK937830.1）的同源性為99.7%，高于TONG 株S1與M41參考株S1的同源性99.0%。以上結(jié)果顯示，不同來(lái)源M41疫苗株的病毒特性出現(xiàn)了多樣性變化。

關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒;M41疫苗株; 病毒特性

中圖分類號(hào)：S858.31? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2021）1-0021-04

雞傳染性支氣管炎（IB）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性疾病[1-3]。雞傳染性支氣管炎病毒極易造成呼吸道疾病的繼發(fā)感染，使疫情變得更加復(fù)雜，病死率升高，而且臨床型感染和亞臨床型感染均會(huì)使雞群生產(chǎn)性能下降，飼料報(bào)酬降低，且常常繼發(fā)或并發(fā)大腸桿菌病、葡萄球菌病、支原體感染等等，導(dǎo)致死淘率增加，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。雞傳染性支氣管炎病毒M41株是目前我國(guó)生產(chǎn)含有IBV抗原成分滅活疫苗所使用的制苗毒株，該毒株生物學(xué)特性穩(wěn)定，免疫原性良好[5]。

在實(shí)際疫苗的生產(chǎn)及檢驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，部分產(chǎn)品中雞傳染性支氣管炎病毒效力檢驗(yàn)結(jié)果偏低，甚至達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求，困擾著此類疫苗的生產(chǎn)及應(yīng)用。為了更好地保護(hù)雞免受IB的侵害，制備出最佳疫苗[6]，我們通過(guò)不同來(lái)源雞傳染性支氣管炎病毒M41株的比較，為此類疫苗生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

1? 材料和方法

1.1? 毒株? 雞傳染性支氣管炎病毒（TONG-IBV株）E2代，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng);雞傳染性支氣管炎病毒（MOU-IBV株）E2代，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所惠贈(zèng)。

1.2? 試驗(yàn)用雞? SPF雞，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;SPF種蛋，購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3? 檢測(cè)試劑? IB HI 試驗(yàn)用抗原，購(gòu)自荷蘭GD公司（批號(hào)：20680-270120）。

1.4? 設(shè)備? 組織搗碎勻漿機(jī)（JJ-2），購(gòu)自常州榮華儀器制造有限公司;雞隔離器（正壓GJ-1），購(gòu)自蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司。

1.5? 試驗(yàn)方法

1.5.1? 抗原的制備? 將兩株M41毒株用滅菌生理鹽水分別作100倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種11日齡的SPF雞胚30枚，每胚0.2 mL，接種后密封針孔，置36.5 ℃繼續(xù)孵育，不必翻蛋。接種后33 h照蛋1次，棄去死胚，活胚全部取出，氣室向上直立，置于4 ℃冷卻12 h后收取尿囊液于滅菌瓶中，同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行病毒含量檢驗(yàn)[7]并觀察雞胚病變特點(diǎn)，剩余的尿囊液-20 ℃保存?zhèn)溆谩？乖斋@批號(hào)分別為TONG-0901、MOU-0901。

1.5.2? 抗原的滅活? 將兩株M41種毒制備的抗原加入10%甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.15%，37 ℃滅活18 h（以抗原溫度達(dá)到37 ℃開始計(jì)時(shí)），其間每隔4 h攪拌一次。停止滅活后，從滅活瓶?jī)?nèi)取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活后的病毒液置4 ℃保存，抗原滅活批號(hào)分別為TONG-200901、MOU-200901。

1.5.3? 試驗(yàn)疫苗的制備? 將兩組滅活后檢驗(yàn)合格的抗原制備水相，按照水相和油相比1∶2在組織搗碎機(jī)進(jìn)行乳化，制備兩組抗原的滅活疫苗[8]，批號(hào)分別是TONG-20200901、MOU-20200901。

1.5.4? 免疫? 用4周齡SPF雞30只，分為2組，每組15只，各點(diǎn)眼接種雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）1羽份。接種21日后，對(duì)試驗(yàn)雞采血并分離血清。第1組，各頸部皮下注射雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（TONG）0.5 mL/只;第2組，各頸部皮下注射雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（MOU）0.5 mL/只。接種后28日，分別采血、分離血清，并將兩次血清分別按血凝抑制試驗(yàn)操作方法作HI檢測(cè)[9]。

1.5.5? 2個(gè)不同來(lái)源IBV-M41株S1基因序列分析? 參照GenBank中的IBV M41株纖突蛋白S1編碼序列附近的相對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)上、下游引物，提取兩個(gè)病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，測(cè)序分析兩個(gè)不同來(lái)源M41的差異，并通過(guò)MegAlign軟件對(duì)TONG-IBV和MOU-IBV的S1編碼基因序列進(jìn)行比對(duì)。

2? 試驗(yàn)結(jié)果

2.1? 病毒含量測(cè)定? 結(jié)果見表1。

2.2? 雞胚病變特點(diǎn)? 兩株不同來(lái)源的M41分別接種11日齡SPF雞胚，雞胚病變相同點(diǎn)：胚體均發(fā)育小，明顯小于對(duì)照組雞胚;不同點(diǎn)：接種TONG-IBV雞胚出血較嚴(yán)重，蜷縮較輕，病變率73%，見圖1;接種MOU-IBV雞胚體脫水，呈典型的蜷縮狀[10]，病變率67%，見圖2;對(duì)照組見圖3。

2.3? 免疫原性分析? 試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可見，雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（MOU株）抗體增長(zhǎng)倍數(shù)為6.06倍，明顯高于雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（TONG株）抗體增長(zhǎng)倍數(shù)1.87倍，表明MOU-IBV株的免疫原性更好。

2.4? S1基因的測(cè)序結(jié)果? 將IBV兩個(gè)疫苗株（M41）S1基因的測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的IBV代表毒株的S1基因序列進(jìn)行比較，其同源性分析與進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖4、圖5。

同源性分析結(jié)果顯示MOU-IBV-S1與M41-IBV-S1的同源性為99.7%，并且處于進(jìn)化樹同一分支上，而TONG-IBV-S1與M41-IBV-S1的同源性為99.0%，因此MOU-IBV-S1與M41-IBV-S1的同源性更近。

通過(guò)MegAlign軟件對(duì)TONG-IBV、MOU-IBV纖突蛋白S1編碼基因序列比對(duì)結(jié)果見圖6、圖7。

通過(guò)MegAlign軟件對(duì)TONG-IBV、MOU-IBV纖突蛋白S1編碼基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示二者存在4個(gè)堿基位點(diǎn)的突變，進(jìn)一步比對(duì)其氨基酸序列，表明有3個(gè)氨基酸發(fā)生改變。第837位堿基由A突變?yōu)镃，該堿基處于編碼第279位氨基酸密碼子的第三個(gè)堿基，它的突變并未引起氨基酸的變化;第851位堿基由C突變?yōu)锳，該堿基位于編碼第284位氨基酸密碼子的第二個(gè)堿基，它的突變直接導(dǎo)致第284位氨基酸由脯氨酸P變?yōu)榻M氨酸H;第881位堿基由A突變?yōu)镚，該堿基位于編碼第294位氨基酸密碼子的第二個(gè)堿基，它的突變直接導(dǎo)致第294位氨基酸由谷氨酰胺Q突變?yōu)榫彼酭，第949位堿基由G突變?yōu)锳，該堿基位于編碼第317位氨基酸密碼子的第二個(gè)堿基，它的突變直接導(dǎo)致第317位氨基酸由谷氨酸E突變?yōu)橘嚢彼酜。

3? 討論

本試驗(yàn)雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（MOU-IBV株）組效價(jià)明顯高于雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（TONG-IBV株）組，可能是由于TONG-IBV纖突蛋白S1編碼基因堿基位點(diǎn)的突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生突變，改變了蛋白序列及結(jié)構(gòu)，從而引起了兩個(gè)M41株生物學(xué)特性和免疫原性的差異。通過(guò)對(duì)2個(gè)不同來(lái)源的雞傳染性支氣管炎病毒（M41）毒株免疫原性進(jìn)行比較，說(shuō)明相同的毒株之間存在著差異，導(dǎo)致免疫原性有所不同，有可能造成免疫失敗。本試驗(yàn)為含有雞傳染性支氣管炎病毒（M41）株相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Abstract：To compare the biological characteristics， immunogenicity and S1 gene homology of two strains of avian infectious bronchitis virus （M41） from different sources. The 10-day old SPF chicken embryos were inoculated with TONG-IBV and MOU-IBV， respectively， to observe the pathological features of chicken embryos， calculate the viral content （EID50）， Inactivated vaccine was prepared to detect the titer of immune antibody， S1 gene sequencing was performed. The results of the test showed that after inoculation of TONG-IBV strain， the chicken embryo bleeding was more serious and the degree of curling was less， and the chicken embryos inoculated with MOU-IBV showed a typical cowling shape. Homology analysis results showed that the homology between MOU strain S1 and M41 reference strain S1 （GenBank sequence number MK937830.1） was 99.7%， higher than that between TONG strain S1 and M41 reference strain S1 was 99.0%. The above results showed that the virus characteristics of different M41 vaccine strains showed diversity changes.

Keywords：infectious bronchitis virus; M41 vaccine strain; virus characteristics□