雞源和兔源屎腸球菌的耐藥性及相關(guān)基因分析

趙巧雅　路曉　高月花　劉娜　胡峰　劉玉山　劉小群　黃兵

摘? 要：2020年4月，山東省某鴿場(chǎng)及某兔場(chǎng)發(fā)生腹瀉情況，發(fā)病率較高。試驗(yàn)從病鴿及病兔肝臟中各分離到一株革蘭氏陽(yáng)性球菌，通過(guò)16S rRNA測(cè)序鑒定均為屎腸球菌。兩株分離菌均未檢測(cè)到cylA、gelE、ace等8種毒力基因。藥敏試驗(yàn)和耐藥基因結(jié)果顯示，兩個(gè)菌株都對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果也一致。這些結(jié)果提示屎腸球菌或許能引起鴿及兔感染，對(duì)鴿或兔的臨床治療及公共衛(wèi)生學(xué)具有一定的參考意義。

關(guān)鍵詞：屎腸球菌;分離鑒定;耐藥;毒力基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.31? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2021）1-0005-04

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬腸球菌屬中的一類(lèi)，是人及動(dòng)物的腸道正常菌群之一[1，2]，其代謝產(chǎn)物能夠抑制腸系有害菌[3]、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、改善生產(chǎn)性能等[4]，常作為飼料添加劑在養(yǎng)殖生產(chǎn)中普遍應(yīng)用[5];同時(shí)也是重要的人獸共患條件致病菌，可引起人及動(dòng)物的感染等[6]，且可通過(guò)污染的食物傳播給人[7]，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義，因此在生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格篩選菌種。

2020年4月，山東省某鴿場(chǎng)鴿子零星出現(xiàn)精神沉郁、水樣腹瀉，一周內(nèi)死亡。同期，某兔場(chǎng)仔兔也發(fā)生腹瀉情況。本研究以發(fā)病鴿和發(fā)病仔兔為研究對(duì)象，分別無(wú)菌采集肝臟進(jìn)行分菌，通過(guò)純化、16S rDNA測(cè)序、生化試驗(yàn)、藥物敏感性試驗(yàn)等完成菌種鑒定，利用耐藥基因檢測(cè)分析分離菌的耐藥性，為臨床治療及公共衛(wèi)生提供參考。

1? 材料

1.1? 病料來(lái)源? 病料來(lái)源于發(fā)病鴿場(chǎng)與兔場(chǎng)。

1.2? 試劑? 2000 DNA Maker購(gòu)自天根生化科技;pMD-18T克隆載體購(gòu)自TaKaRa公司;PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自Axygen公司;細(xì)菌微量生化管購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;藥敏紙片購(gòu)自北京艾博利德商貿(mào)有限公司;甘油、1×TE緩沖液、細(xì)菌培養(yǎng)基及其他試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2? 方法

2.1? 細(xì)菌分離純化? 無(wú)菌條件下分別取病鴿及病兔肝臟，接種于5%胎牛血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察記錄細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及形態(tài)。挑取培養(yǎng)或純化后的單菌落，涂片進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

2.2? 生化試驗(yàn)? 參照伯杰氏手冊(cè)，使用杭州濱和微生物試劑有限公司的細(xì)菌微量生化管，按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

2.3? PCR鑒定? 16S rRNA基因片段通用引物，27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3';1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取單個(gè)細(xì)菌菌落懸浮于50 μL生理鹽水作為模板，按照如下比例配制反應(yīng)體系：模板1 μL，上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，補(bǔ)充去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T 載體，鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司。

2.4? 藥敏試驗(yàn)? 按照WHO推薦的瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B）對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏檢驗(yàn)，結(jié)果按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)做出判定。

2.5? 耐藥基因及毒力基因檢測(cè)? 11種耐藥基因[8][（VanA、VanB、qnrA、tetE、flo R、aac（6'）-I、tet M、erm B、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M）]和8種毒力基因（cylA、gelE、ace、agg、esp、efaA、acm、fsr）引物序列參照文獻(xiàn)[9，10]合成。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank序列比對(duì)。

3? 結(jié)果與分析

3.1? 細(xì)菌分離情況? 從病鴿、病兔中各分離出1株細(xì)菌，分別命名為G0401、T0402，2株分離菌在有氧和微厭氧的條件下均可生長(zhǎng)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，在血清板上呈現(xiàn)灰白色半透明、圓形微凸、表面光滑、濕潤(rùn)的小菌落，菌落大小在0.5～2.0 mm之間。1000×鏡檢為單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀的G+球菌。

3.2? 生化試驗(yàn)? 兩株分離菌均能發(fā)酵木糖、蔗糖，均能水解精氨酸，不發(fā)酵山梨醇、甘露醇，不液化明膠，均符合腸球菌生化特性。

3.3? 16S rDNA的測(cè)序結(jié)果及同源性分析? PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，兩株分離菌擴(kuò)增序列大小約為1500 bp的目的條帶;鴿源、兔源分離株擴(kuò)增序列測(cè)序后與NCBI公布的登錄號(hào)為CP044264.1參考序列同源性分別達(dá)99.67%、99.74%，兩株分離菌鑒定為屎腸球菌，見(jiàn)圖1、圖2。

3.4? 藥敏試驗(yàn)? 結(jié)果見(jiàn)表1。

兩株分離菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、林可霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、阿米卡星、多粘菌素、土霉素均為低敏，對(duì)新霉素均為中敏;鴿源分離株對(duì)恩諾沙星中敏，對(duì)氟苯尼考高敏，對(duì)強(qiáng)力霉素中敏;兔源分離株對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、加替沙星高敏，對(duì)氟苯尼考中敏，對(duì)強(qiáng)力霉素低敏。

3.5? 耐藥基因和毒力基因檢測(cè)? 結(jié)果顯示，在鴿源分離株及兔源分離株上均發(fā)現(xiàn)2個(gè)（erm B、blaTEM）抗生素抗性基因;然而8種毒力基因均未檢測(cè)到。

4? 討論及結(jié)論

本研究中從發(fā)病鴿、兔中分離出的兩株分離菌經(jīng)鑒定均為屎腸球菌。兩者耐藥表型存在部分差異，但耐藥基因型及毒力基因均一致，均未檢出耐萬(wàn)古霉素耐藥基因。對(duì)氨基糖胺類(lèi)及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的耐藥表型與基因型一致，四環(huán)素類(lèi)耐藥基因的耐藥表型與基因型不一致，提示該地區(qū)的腸球菌或許存在其他耐藥機(jī)制及致病機(jī)制等。利用《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》等標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分離株鑒型可能不合適，因?yàn)楸硇驮囼?yàn)對(duì)腸球菌鑒定所用的典型菌株都是人源的，因此分離株與標(biāo)準(zhǔn)中表型可能存在一定的差異[11]。兩株屎腸球菌雖來(lái)源不同，但序列及生化特性極為相似，且均在腹瀉病例中分離，建議臨床生產(chǎn)中鴿和兔不要混養(yǎng)，以免引起交叉感染。

腸球菌屬于人和動(dòng)物腸道中正常存在的菌群，但異位寄生于其他器官會(huì)引起感染[12]。腸球菌作為一種益生菌廣泛在飼料中添加，伴隨抗生素的濫用及環(huán)境的影響出現(xiàn)了較多的耐藥性菌株及致病株，在臨床治療及飼料添加使用時(shí)應(yīng)提高警惕，盡量減少抗生素的使用，本研究中該分離株是否存在致病性及其他毒力基因（hyl、SagA等）還需進(jìn)一步研究。

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Abstract： In April 2020， diarrhea occurred in a pigeon farm and a rabbit farm in Shandong Province， and the incidence rate was high. One gram-positive cocci was isolated from the liver of pigeon and rabbit， and identified as Enterococcus faecium by 16S rRNA sequencing. 8 virulence genes such as cylA、gelE and ace were not detected in the two isolates. The results of drug sensitivity test and drug resistance gene showed that both strains were resistant to β-lactams， and the results of drug resistance gene detection were consistent. These results suggest that Enterococcus faecium may be able to cause infection in pigeons and rabbits， which has certain reference significance for clinical treatment and public health of pigeons or rabbits.

Keywords： Enterococcus faecalis;Separation and identification;Drug resistance;Virulence genes

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