核酸混樣檢測(cè)中假反應(yīng)性的原因分析和質(zhì)量控制

張龍穆，袁欣，楊忠思*

(1.青島市中心血站，山東 青島 266000；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000)

0 引言

核酸檢測(cè)(nucleic acid amplification test，NAT)技術(shù)因檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，極大地降低輸血傳播病毒的殘余危險(xiǎn)度[1,2]，歐美地區(qū)等發(fā)達(dá)國(guó)家從上世紀(jì)90年代開始逐漸將NAT技術(shù)應(yīng)用到血液篩查中[3]。2016年開始NAT已全面應(yīng)用于國(guó)內(nèi)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本的篩查[4]，為進(jìn)一步推進(jìn)核酸檢測(cè)，規(guī)范開展核酸檢測(cè)后獻(xiàn)血者傳染病篩查的技術(shù)和流程，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委頒布了《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019版)》[5]。但國(guó)內(nèi)采供血系統(tǒng)NAT檢測(cè)人員相對(duì)較少，日常工作忙碌而繁瑣，在試驗(yàn)過(guò)程中可能更注重結(jié)果的有效性，難免出現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中的可能出現(xiàn)的假反應(yīng)性問(wèn)題的重視不足，對(duì)混樣陽(yáng)性pool拆分試驗(yàn)陽(yáng)性率低的問(wèn)題未引起足夠重視。核酸檢測(cè)拆分陽(yáng)性率低不僅浪費(fèi)試劑，還可能威脅到血液安全，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)核酸拆分陽(yáng)性率低的原因和對(duì)策研究較少，我們通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室工作中各環(huán)節(jié)進(jìn)行針對(duì)性分析，找出核酸檢測(cè)拆分陽(yáng)性率低的主要原因加以改進(jìn)，從而進(jìn)一步提高血液質(zhì)量，降低輸血途徑傳播病毒的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采血管：為本站當(dāng)前使用的EDTA-K2抗凝的分離膠試管，為一次性無(wú)菌無(wú)RNA酶真空采血管(BD公司)。

1.2 儀器與試劑

儀器：羅氏cobas S201核酸檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)羅氏)，Hamilton STAR加 樣 儀(瑞 士Hamilton)，Thermo低 速 離 心機(jī)(美國(guó))。試劑：HBV、HCV、HIV-(1+2)NAT聯(lián)合檢測(cè)試劑(cobasTaqScreen MPX)V2.0(美國(guó)羅氏)。

1.3 方法

分析核酸檢測(cè)拆分試驗(yàn)陽(yáng)性率低的原因：統(tǒng)計(jì)本2017年1月至8月陽(yáng)性拆分率，從人、機(jī)、料、法、環(huán)多個(gè)方面，逐項(xiàng)列出可能導(dǎo)致拆分陽(yáng)性率低的原因(圖1)，主要包括：操作人員不良操作習(xí)慣、儀器維護(hù)擦拭不規(guī)范、試劑上機(jī)時(shí)間長(zhǎng)、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本同步太多、環(huán)境定期清潔不足等有關(guān)問(wèn)題。核酸實(shí)驗(yàn)室全體人員集體討論，并邀請(qǐng)羅氏技術(shù)支持進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)，最后初步確認(rèn)為標(biāo)本處理環(huán)節(jié)交叉污染所致，主要改進(jìn)方向：盡量避免核酸與酶免同步檢測(cè)，即減少?gòu)?qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)的次數(shù)，同時(shí)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室工作人員的防污染意識(shí)。統(tǒng)計(jì)分析實(shí)施改進(jìn)措施前后拆分陽(yáng)性率的差異，評(píng)價(jià)改進(jìn)效果。

表1 改進(jìn)前后NAT檢測(cè)拆分陽(yáng)性情況對(duì)比

圖1 實(shí)驗(yàn)室可能導(dǎo)致拆分陽(yáng)性率低的原因

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用

SPSS 13.0軟件對(duì)不同時(shí)間段拆分陽(yáng)性率進(jìn)行比較分析，拆分陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2017年1月至2017年8月份，羅氏核酸系統(tǒng)檢測(cè)49641份ELISA檢測(cè)陰性標(biāo)本中，NAT混樣混項(xiàng)目陽(yáng)性53例，經(jīng)拆分后共檢出陽(yáng)性17例，占總檢測(cè)人數(shù)的0.034%，拆分陽(yáng)性率為32.1%。2017年9月至2018年3月份，羅氏核酸系統(tǒng)檢測(cè)64741份ELISA檢測(cè)陰性標(biāo)本中，NAT混樣混項(xiàng)目陽(yáng)性45例，經(jīng)拆分后共檢出陽(yáng)性24例，占總檢測(cè)人數(shù)的0.037%，拆分陽(yáng)性率為64.4%。實(shí)施改進(jìn)措施前后拆分陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2017年1月至2018年3月份實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)施改進(jìn)措施前后拆分陽(yáng)性率比較，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.238，P＜0.05)，見表1。從9月份實(shí)施改進(jìn)措施以后拆分陽(yáng)性率明顯升高(圖2)。

3 討論

圖2 拆分陽(yáng)性率pool比例變化

核酸擴(kuò)增技術(shù)能顯著縮短人類免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)等病毒檢測(cè)的窗口期，提高病毒的檢出率，2010年開始逐步應(yīng)用于國(guó)內(nèi)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本的篩查，降低了經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)[6]?？紤]到核酸試劑成本等方面，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)還是主要以混樣模式(6混樣或8混樣)進(jìn)行獻(xiàn)血者的血液篩查[1,6]，核酸混樣檢測(cè)模式相對(duì)于單人份檢測(cè)模式，雖然節(jié)約核酸檢測(cè)成本，也帶來(lái)一些問(wèn)題。以本實(shí)驗(yàn)室使用的羅氏S201檢測(cè)系統(tǒng)為例，如果初次混樣陽(yáng)性(6混樣)，為確定具體的陽(yáng)性標(biāo)本，需要進(jìn)一步進(jìn)行單樣本拆分試驗(yàn)，但有一部分拆分試驗(yàn)結(jié)果為全部陰性，據(jù)各地試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年山東省使用羅氏核酸檢測(cè)拆分陽(yáng)性率為64.3%(內(nèi)部交流數(shù)據(jù)，未公開發(fā)表)，而本實(shí)驗(yàn)室2017年1-8月拆分陽(yáng)性率僅為32.1%(表1，2)。按照試劑說(shuō)明書判定規(guī)則，拆分全陰性的6個(gè)標(biāo)本全部判為核酸檢測(cè)合格。雖然初次混樣陽(yáng)性結(jié)果以假反應(yīng)性對(duì)待，但也并不排除某些原因?qū)е潞怂岵鸱衷囼?yàn)的假陰性問(wèn)題的可能性，如核酸檢測(cè)標(biāo)本的處理、保存不當(dāng)，會(huì)造成病毒核酸降解[7,8]。相關(guān)報(bào)道顯示，酶免陰性核酸陽(yáng)性的獻(xiàn)血者通過(guò)追蹤或補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，多數(shù)為隱匿性感染，病毒載量多數(shù)都低于定量檢測(cè)的檢測(cè)下限[9-11]，說(shuō)明隱匿性感染時(shí)一般血液中的病毒載量也非常低，混樣檢測(cè)會(huì)降低試劑的檢測(cè)靈敏度[12]，導(dǎo)致低病毒載量的標(biāo)本核酸檢測(cè)的確存在檢出概率問(wèn)題，有研究顯示通過(guò)超高速離心的方法使低濃度的陽(yáng)性標(biāo)本鑒別率明顯提高[13]，因此拆分陰性標(biāo)本是否可以斷定初次混檢就是假反應(yīng)性也有待考證。

核酸檢測(cè)影響因素眾多，如操作人員因素、儀器誤差因素、獻(xiàn)血者血液標(biāo)本及試劑質(zhì)量因素、實(shí)驗(yàn)操作因素、環(huán)境因素等。筆者針對(duì)拆分陽(yáng)性率低的問(wèn)題進(jìn)行可能原因分析(圖1)，核酸實(shí)驗(yàn)室全體人員集體討論，并邀請(qǐng)羅氏技術(shù)支持進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)，最后初步確認(rèn)為標(biāo)本處理環(huán)節(jié)交叉污染所致，主要原因可能是前期酶免核酸同步檢測(cè)較多(2016至2017年因生育政策調(diào)整，本實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)假人數(shù)較多，導(dǎo)致核酸工作人員不足)，確定主要改進(jìn)方向：避免核酸與酶免同步檢測(cè)，即減少?gòu)?qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)的次數(shù)，同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室全體人員集體討論的方式，也使實(shí)驗(yàn)室工作人員主動(dòng)提升的日常工作中的防污染意識(shí)。采取積極有效的改進(jìn)措施后，2017年9月至2018年3月份，羅氏核酸系統(tǒng)檢測(cè)64741份ELISA檢測(cè)陰性標(biāo)本中，NAT混樣混項(xiàng)目陽(yáng)性45例，經(jīng)拆分后共檢出陽(yáng)性24例，占總檢測(cè)人數(shù)的0.037%，拆分陽(yáng)性率為64.4%。采取有效的措施使改進(jìn)前后未拆分出數(shù)量明顯減少(32.1% VS 64.4%，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者認(rèn)為因各實(shí)驗(yàn)室情況各異，出現(xiàn)類似拆分率低的情況應(yīng)列出的可能的原因，應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體情況進(jìn)行逐個(gè)排除，最后針對(duì)主要的一個(gè)或幾個(gè)原因進(jìn)行改進(jìn)，當(dāng)然每一次改進(jìn)主要還是應(yīng)該重視人的因素，重視改進(jìn)-培訓(xùn)-評(píng)估的重要性。

雖然有學(xué)者認(rèn)為NAT混樣混項(xiàng)目陽(yáng)性而未拆分出的標(biāo)本，不能完全排除極低病毒濃度的情況出現(xiàn)[14,15]。但本室每次拆分實(shí)驗(yàn)所設(shè)陰性室內(nèi)質(zhì)控均在控，故可認(rèn)為假陰性導(dǎo)致的未拆分出實(shí)驗(yàn)為小概率事件(當(dāng)然也不能完全排除極低病毒濃度的情況出現(xiàn))，對(duì)于本文的拆分陽(yáng)性率的統(tǒng)計(jì)比較誤差可以忽略。筆者認(rèn)為對(duì)于未拆分出樣本，可以考慮增加拆分次數(shù)或用另一種不同原理的檢測(cè)系統(tǒng)再次檢測(cè)，驗(yàn)證能否提高拆分陽(yáng)性率，我們將通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)室從2017年9月份實(shí)施的上述一系列改進(jìn)措施，明顯提高了核酸檢測(cè)拆分陽(yáng)性率。針對(duì)拆分陽(yáng)性率低的問(wèn)題進(jìn)行可能原因分析，核酸實(shí)驗(yàn)室全體人員集體討論，最后初步確認(rèn)為標(biāo)本處理環(huán)節(jié)交叉污染所致，主要原因可能是前期酶免核酸同步檢測(cè)較多，確定主要改進(jìn)方向：避免核酸與酶免同步檢測(cè)，即減少?gòu)?qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)的次數(shù)，同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室全體人員集體討論的方式，也使實(shí)驗(yàn)室工作人員主動(dòng)提升的日常工作中的防污染意識(shí)。