不同性型水果黃瓜內(nèi)過氧化物酶及同工酶的差異性分析

王鶴冰，向華豐，張洪成，張 生

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329）

水果黃瓜又稱迷你黃瓜、小黃瓜，是從歐洲引進(jìn)的主要適宜溫室栽培的鮮食類黃瓜品種，在很多地區(qū)作為名特優(yōu)蔬菜被廣泛引種栽培［1］。水果黃瓜作為黃瓜的一個(gè)分支，主要分布在英國(guó)、荷蘭等地［2］。由于引種較晚，中國(guó)目前此類資源缺乏，生產(chǎn)用種多為外國(guó)品種。為提升國(guó)內(nèi)的自主育種能力，近年來側(cè)重在資源的搜集與創(chuàng)制上下文章。目前，我國(guó)引種的水果黃瓜品種多為雌性系，不能自交繁殖［3］，且制種過程較繁瑣。為了培育出優(yōu)良的水果黃瓜品種，創(chuàng)制出不同性型的水果黃瓜材料十分必要。

通過多年的材料引進(jìn)與純化篩選，我國(guó)不同類型的水果黃瓜材料逐漸增加，不同性型的育種材料也逐漸出現(xiàn)，但急需找到一個(gè)簡(jiǎn)單便捷的性型鑒定方法。

黃瓜材料性型的判斷方法很多，最直觀的方法是在生育期進(jìn)行田間自然鑒定，但耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，受環(huán)境影響大。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)逐漸應(yīng)用于作物輔助育種，找到與所需性狀密切相關(guān)的特異性分子標(biāo)記，是在不同環(huán)境影響下，對(duì)作物復(fù)雜性狀進(jìn)行判斷的有效途徑。近年來分子標(biāo)記在黃瓜雌性系選育中逐步應(yīng)用，如厲建梅等用SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行黃瓜雌性性狀的多態(tài)性篩選，得到標(biāo)記位點(diǎn)21個(gè)［4］；苗晗等將F9代RILs 群體用于復(fù)雌花QTL 的定位分析，從中找到8 個(gè)控制復(fù)雌花性狀的QTL 位點(diǎn)［5］。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展也為后來雌性基因的定位奠定了基礎(chǔ)。但無論哪個(gè)方法，對(duì)于常規(guī)的育種者來講，都存在一定的局限性，因而研究還在進(jìn)一步深入。

1995 年，馬蓉麗在進(jìn)行黃瓜雌性系選育時(shí)，對(duì)黃瓜雌性系和其他品種粗淺地進(jìn)行了種子萌動(dòng)時(shí)期的過氧化物同工酶分析，發(fā)現(xiàn)雌性系與其他品種比較存在差異［6］，但未做進(jìn)一步研究。之后此方面的研究也并未引起重視，但如果酶的差異可區(qū)分黃瓜材料的性型，將是一個(gè)快速的檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，以不同性型的水果黃瓜姊妹系為試驗(yàn)材料進(jìn)行研究，尋找不同性型水果黃瓜中過氧化物酶及同工酶的差異，以其為材料選擇中性型的判斷提供一個(gè)快速的評(píng)判方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黃瓜課題組自己篩選純化出的2 對(duì)水果黃瓜姊妹系（A1-A2，B1-B2）為試驗(yàn)材料。性型類別見表1。

表1 試驗(yàn)材料性型

試驗(yàn)材料于春季在田間自然條件下播種、育苗，在植株3葉1心期進(jìn)行取樣，取葉片部分用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料性型的田間鑒定

為確定材料的性型穩(wěn)定性與一致性，在田間自然條件下進(jìn)行性型鑒定［7］。試驗(yàn)在春秋兩季不同溫度環(huán)境下進(jìn)行，以消除溫度對(duì)黃瓜性型分化的影響。

材料采取常規(guī)穴盤育苗方式，3葉1心時(shí)定植于露地，每份材料隨機(jī)選取10 株，調(diào)查其20 節(jié)內(nèi)的雌花節(jié)位。

1.2.2 過氧化物酶測(cè)定

過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［8］進(jìn)行。

樣品制備的步驟：稱取0.2 g葉片組織，加入1 mL提取液，在冰浴上研磨成勻漿。于12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，置于冰面上待用。

1.2.3 過氧化物同工酶電泳分析

過氧化物同工酶電泳采用垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)［8］進(jìn)行。

每個(gè)試驗(yàn)材料隨機(jī)取樣兩份作為重復(fù)，進(jìn)行同工酶電泳試驗(yàn)。

樣品制備步驟：稱取試驗(yàn)材料葉片0.5 g加入液氮研磨成粉末狀，加入1.5 mL Tris-Hcl繼續(xù)研磨成勻漿，倒入5 mL離心管中，再分次用2 mL Tris-Hcl將研缽沖洗干凈轉(zhuǎn)入離心管中。在11 000 r·min-1、4 ℃條件下離心20 min，取上清液（酶提取液），將其分裝在2 mL 離心管中與溴酚藍(lán)（1.5 mL 酶提取液+20 μL 溴酚藍(lán)）混合均勻后，置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 雌性系材料的確定

因黃瓜的性型分化受溫度影響較大，因而在試驗(yàn)進(jìn)行前，再次對(duì)所選取的各水果黃瓜試驗(yàn)材料性型進(jìn)行鑒定，確保后續(xù)試驗(yàn)材料性型具有代表性。

從表2 的各材料平均雌花節(jié)位數(shù)統(tǒng)計(jì)可見，雌性系材料的雌花節(jié)位穩(wěn)定，而普通株系在春秋兩季的雌花節(jié)位數(shù)變化較大，在B2材料中秋季雌花節(jié)位數(shù)降低了16%。對(duì)各材料的雌花節(jié)率（見表3）進(jìn)行計(jì)算，可見兩對(duì)材料現(xiàn)狀穩(wěn)定，均為一個(gè)雌性系，一個(gè)普通株，其中A1 為全雌株，雌花率100%，即無論在任何環(huán)境下均無雄花出現(xiàn)。

表2 各材料平均雌花節(jié)位統(tǒng)計(jì)

表3 各材料雌花節(jié)率統(tǒng)計(jì)

2.2 過氧化物酶活性分析

測(cè)定各材料的過氧化物酶，對(duì)2 對(duì)材料的過氧化物酶活性進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖1。兩對(duì)材料中，雌性系材料的過氧化物酶活性均明顯高于普通株系，B1的酶活比B2高44%，而A1（全雌株類型的雌性系）的酶活更高，較對(duì)應(yīng)的A2普通株系高56%?？梢娝S瓜中雌性比例越高，其過氧化物酶活性越強(qiáng)。但2對(duì)材料中雌性系與普通株間的過氧化物酶活性的臨界值還有待進(jìn)一步探索。

圖1 各材料的過氧化物酶活性

2.3 過氧化物同工酶譜帶分析

從各材料的同工酶電泳圖（見圖2）中可清楚的看見，在每個(gè)姊妹系中，雌性系材料的同工酶譜帶最后一條與普通株系均有明顯差異。

雌性株系的同工酶譜有明顯的3 條條帶，而普通株系只有2 條明顯的條帶；在普通株系電泳圖中，A2材料的第3 條譜帶顏色很淡，B2 材料的第3 條譜帶甚至完全消失不見。

圖2 各材料的同工酶電泳圖

3 小結(jié)

性型在黃瓜育種中有著重要的地位，特別是當(dāng)黃瓜育種工作由常規(guī)育種逐漸轉(zhuǎn)向雜交育種后，雌性系更是因其簡(jiǎn)便易行的制種技術(shù)被育種者們?cè)谘芯亢屠弥袕V泛青睞［9］。因而找到一個(gè)簡(jiǎn)易的材料鑒別方式對(duì)材料的選擇十分必要。水果黃瓜材料中多數(shù)為雌性系，因而以其為試材，具有代表性。

抗氧化系統(tǒng)是植物抵抗逆境脅迫的重要防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、（過氧化氫酶）CAT 和過氧化物酶（POD）是植物清除活性氧的重要抗氧化防御酶［10］。黃瓜的性型分化與溫度關(guān)系密切，如溫度在正常水平上升高，其雌花分化率明顯降低，這可能與抗高溫逆境脅迫有關(guān)，因此該試驗(yàn)就黃瓜雌性與POD間的相關(guān)性展開研究。

試驗(yàn)通過對(duì)水果黃瓜雌性系與其姊妹系的普通株系間的過氧化物酶活性及同工酶電泳譜帶的比較分析，得到了水果黃瓜普通系與雌性系間過氧化物酶的明顯差異，雌性系材料的過氧化物酶活性明顯升高，且同工酶譜帶有明顯的3 條；而普通株系中，過氧化物酶活性相對(duì)較低，且同工酶譜帶只用2條清晰譜帶，第3條譜帶顏色很淺，甚至消失。