水稻多胚基因CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建

陳 強，何 勇，田志宏

（長江大學生命科學學院/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心/澇漬災害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點實驗室，湖北荊州 434025）

正常情況下水稻有性生殖的過程中只產(chǎn)生一個胚囊，一個胚囊只含有一個受精卵，受精后也只能發(fā)育一個胚［1］。通過自然進化產(chǎn)生的一些多胚性水稻，其種子無規(guī)律地分布在穗子中，且其不能夠穩(wěn)定遺傳。水稻多胚基因OsPE是一個功能獲得性的基因，位于水稻的第3 條染色體上，cDNA 全長2 755 bp，含有2個外顯子，到目前為止，在水稻基因組中未發(fā)現(xiàn)OsPE的同源基因［2］。多胚基因在水稻雜交和加速育種等方面都有著重要的應(yīng)用，種子由多到少，生殖由單一胚到二個胚乃至多個胚，可用于水稻多倍體的研究，通過加倍獲得純合的多倍體種子，加強育種優(yōu)勢，縮短育種需要的時間，同時可以節(jié)省母種、提高產(chǎn)量、改良品種等。發(fā)掘多胚基因的遺傳機理，改良多胚基因的遺傳穩(wěn)定性是多胚基因發(fā)揮應(yīng)用價值的重要前提。

基因組編輯技術(shù)是近幾年興起的一項能對基因組進行精確修飾的技術(shù)，通過使用核酸內(nèi)切酶在基因組中可完成堿基的替換、插入、彌補小片段缺失等［3-4］。此外，具有轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的修改版本，允許對靶基因進行強有力的轉(zhuǎn)錄抑制或激活［5］。CRISPR/Cas9 主要由single-guide RNA和其引導的Cas9 蛋白兩部分組成，CRISPR/Cas9 技術(shù)不僅適用性廣，還可以同時進行多重靶向的編輯，且脫靶率比其他編輯方式低。近年來，基因編輯技術(shù)在水稻育種方面得到了大量應(yīng)用，借助基因編輯的手段，通過T-DNA 的插入，使基因序列發(fā)生一定的突變，能夠獲得一些穩(wěn)定遺傳的植物材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試大腸桿菌菌株DH10B 和根癌農(nóng)桿菌EHA105由本實驗室保存，pYLCRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)由華南農(nóng)業(yè)大學劉耀光教授惠贈。實驗中使用的高保真酶、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 靶點選擇及引物設(shè)計

根據(jù)在NCBI 中公布的水稻基因組序列，查找多胚基因OsPE的序列。利用在線軟件CRISPR-P 分析多胚基因的靶點特異性，在ORF 功能結(jié)構(gòu)區(qū)域篩選挑選合適的靶點，靶點的GC 含量不低于40%，選擇合適的Cas9靶點序列為T1：TGCTCTGTCTGAGTAAAGCA。利用Primer-5 軟件設(shè)計編輯引物，引物由擎科（武漢）生物科技有限公司合成，純化級別PAGE。依據(jù)靶位點序列及sgRNA構(gòu)建方法選擇引物（見表1）。

1.3 sgRNA表達盒的構(gòu)建

以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ載體質(zhì)粒為模板，通過兩步Overlapping PCR 往sgRNA 表達盒中導入靶序列。第1 步使用高保真DNA 聚合酶構(gòu)建一個10 μL 的反應(yīng)體系，在這個反應(yīng)中使用4 種引物，U-F 和gR-R 各0.5 μL，gRT1 和OsU6aT1 各0.25 μL。反應(yīng)進行25 個循環(huán)，95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸45 s。第2 步使用2 種引物，Pps-GGL 和Pgs-GGR 各0.4 μmol·L-1，反應(yīng)程序同上。對反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠檢測和測序檢測。本實驗表達盒由來源于水稻的RNA 啟動子U6a啟動。

表1 引物名稱及序列

1.4 重組載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

利用限制性核酸內(nèi)切酶BsaI識別位點與切割位點不重疊的特性，采用Golden gate cloning 法構(gòu)建雙元載體［6-7］。選擇適用于單子葉植物的pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H 載 體，pYLCRISPR/Cas9 質(zhì)粒使用BsaI酶進行酶切，1 μg 的質(zhì)粒反應(yīng)30 min，反應(yīng)溫度37 ℃，獲得線性化載體。然后T4DNA ligase 對pYLCRISPR/Cas9質(zhì)粒和上述gRNA 表達盒進行連接，利用Golden gate cloning 法將其克隆至pYLCRISPR/Cas9 的BsaI位點。反應(yīng)體系見表2。

反應(yīng)程序：10 ℃反應(yīng)5 min，20 ℃反應(yīng)5 min，共進行15個循環(huán)。將重組產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH10B中，37 ℃平板涂布放置過夜，重組的載體質(zhì)粒中含有卡那抗性基因，用含有50 mg·L-1的LB培養(yǎng)基篩選陽性菌落，也可以加入X-gal 和IPTG 進行藍白斑篩選。

表2 Golden gate cloning反應(yīng)體系

1.5 轉(zhuǎn)化子的檢測

挑取平板上的單克隆菌擴大培養(yǎng)，同時對菌落進行PCR 檢測，菌落PCR 中使用的引物為CRISPRCX-F和CRISPRCX-R。反應(yīng)程序：94 ℃預處理90 s，94 ℃高溫變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃片段延伸90 s，最后延伸5 min，共進行30 個循環(huán)。凝膠電泳檢測結(jié)果為陽性克隆，對陽性克隆分別進行2 個靶點特異性引 物CRISPRCX-F/OsU6aT1 和gRT1/CRISPRCX-R 的檢測，PCR 的反應(yīng)程序與上面相同，檢測陽性克隆的插入方向。挑選部分陽性克隆重組菌提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒送擎科（武漢）生物科技有限公司進行測序，測序引物同上檢測引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA表達盒的獲取

用Overlapping PCR 法通過特異性引物對pYLsgRNA-OsU6a/LacZ 啟動子質(zhì)粒進行擴增，經(jīng)過兩輪PCR 擴增，對第二輪PCR 產(chǎn)物進行凝膠電泳，獲得片段大小應(yīng)為831 bp，凝膠電泳結(jié)果與預期相符（見圖1），部分顯示無條帶可能與第二輪PCR 底物濃度有關(guān)。

圖1 Overlapping PCR電泳圖

2.2 表達載體的獲得與驗證

對PCR 產(chǎn)物直接進行回收，利用Golden gate cloning 法將其連接到BsaI酶切后的載體CRISPR/Cas9 中。提取轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒，用MiuI酶切重組質(zhì)粒鑒定是否連接成功，結(jié)果顯示切出與預期大小相同的目的片段，表明已成功連接（見圖2）。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)有兩個主要組成部分，其中一個是單一的引導RNA （sgRNA），它識別特定的DNA序列，以及在目標位點產(chǎn)生DSB的Cas9蛋白［8-10］，因此在改變sgRNA 的設(shè)計時，可以靈活地選擇多種位點。本研究中跟Cas9 相關(guān)的基因由Pubi-H 啟動子驅(qū)動，而sgRNA 則是由來源于水稻的U6a 驅(qū)動［11］，以確保轉(zhuǎn)錄出的特異性單導RNA 能夠進入細胞核中與Cas9 蛋白結(jié)合，構(gòu)建的載體中用于水稻材料篩選的抗生素是潮霉素。載體圖譜見圖3，根據(jù)CRISPR/Cas9載體圖譜改良。

圖2 凝膠電泳圖

圖3 pYLCRISPR/Cas9-gRNA載體圖譜

2.3 轉(zhuǎn)化菌的PCR檢測

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10B后，挑取呈現(xiàn)出藍斑的單菌落置于搖床放大培養(yǎng)，對陽性的單菌落進行PCR 檢測，使用引物CRISPRCX-F 和CRISPRCX-R，得到大小亮度適合的片段，符合預期（見圖4）。

同時對陽性單克隆進行一個潮霉素的PCR 驗證，得到大小約750 bp 的片段，2 號孔至11 號孔都克隆出條帶，表明部分表達載體成功轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌（見圖5）。

圖4 測序引物凝膠電泳圖

圖5 潮霉素PCR驗證電泳圖

挑取部分陽性克隆用特異性引物再次進行PCR 驗證，確定挑選菌的DNA鏈克隆插入方向（見圖6）。將構(gòu)建好的載體菌液送出測序，測序同樣使用引物CRISPRCX-F 和CRISPRCX-R，測序結(jié)果顯示完全正確，多次檢測表明載體pYLCRISPR/Cas9-gRNA-OsPE構(gòu)建是成功的。將通過檢測的pYLCRISPR/Cas9-gRNA載體質(zhì)粒導入感受態(tài)的農(nóng)桿菌EHA105中，獲得的陽性克隆農(nóng)桿菌即可用于侵染水稻愈傷材料。

圖6 靶點特異性引物組合PCR電泳圖

3 討論

CRISPR/Cas9 載體系統(tǒng)作為一種新興的基因編輯系統(tǒng)，在植物中已經(jīng)有多例應(yīng)用和驗證，目前尚未有利用CRISPR/Cas9 載體系統(tǒng)對多胚相關(guān)基因編輯的報道。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)相對于其他編輯技術(shù)效率更加顯著，且操作更便捷。相對于其他編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 的編輯效率有了明顯的提升，容錯率也大大提高，且CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯不攜帶任何外源DNA，這是其他編輯方式所不具備的。

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)可編輯的位點在整個基因組范圍內(nèi)分布頻率較高，很容易篩選出合適的靶點進行基因編輯。CRISPR-Cas9 可以同時對基因組進行多位點編輯，大大提高了基因編輯的效率。該編輯系統(tǒng)的優(yōu)勢還在于其載體構(gòu)建簡單且靶向效率很高，只需要構(gòu)建一個CRISPR sgRNA 即可與DNA 序列進行匹配，從而介導Cas9 蛋白對DNA 序列進行切割，同時可以更有效地去除假陽性。CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種有效和通用的生物技術(shù)工具，將對基因組工程的未來發(fā)展產(chǎn)生重大影響［12］。

CRISPR 的最終目的就是對其現(xiàn)有的基因組序列進行一系列編輯，通過外源T-DNA的插入，使水稻基因序列發(fā)生一定的突變，影響OsPE相關(guān)功能蛋白的合成和特定靶序列的識別，影響水稻外在的表型，最終得到突變的水稻植株，其后代種子發(fā)芽時可能出現(xiàn)兩個或者多個胚。

本研究通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，先借助靶點特異性引物，經(jīng)過兩輪Overlapping PCR 對U6 啟動子進行擴增，得到一個相應(yīng)sgRNA 的表達盒，然后用Golden gate cloning 法將sgRNA 表達框克隆到載體中相應(yīng)的靶位點，經(jīng)過多次檢測與驗證，最終獲得了針對水稻多胚基因OsPE的pYLCRISPR/Cas9-gRNA 編輯載體，為進一步利用基因編輯技術(shù)改良多胚基因的遺傳育種奠定基礎(chǔ)。