限制型心肌病患兒致病基因檢測(cè)1 例報(bào)告

揚(yáng) 翼 謝利劍 肖婷婷 侯翠蘭

上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 上海市兒童醫(yī)院心內(nèi)科（上海 200062）

限制型心肌?。╮estrictive cardiomypathy，RCM）是一種罕見(jiàn)的非缺血性心臟病，是以心室心內(nèi)膜纖維化、心室舒張功能障礙為特征的一類心肌病[1]，臨床少見(jiàn)，約占心肌病的5%，但預(yù)后差，心源性猝死風(fēng)險(xiǎn)高，特別是兒童生后2 年、5 年病死率分別約為50%、70%，心臟移植通常成為最終的治療手段[2]。原發(fā)性RCM 30%為家族性，提示遺傳因素的重要性[3]。RCM的遺傳方式以常染色體顯性遺傳為主，但也可表現(xiàn)為常染色體隱形遺傳。研究表明，基因變異是RCM 發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。目前已在心肌肌鈣蛋白Ⅰ基因（cardiac troponin Ⅰ，TNNI3）、心肌肌鈣蛋白T基因（cardiactroponin T，TNNT 2）、心肌肌鈣蛋白C 基因（cardiac troponin C，TNNC 1）、α-心臟肌動(dòng)蛋白基因（α-cardiac actin，ACTC1）、β-肌球蛋白重鏈基因（β-myosin heavy chain 7，MYH7）、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈基因（myosin regulatory light chain 2，MYL2）、肌球蛋白必需輕鏈基因（myosin regulatory light chain，MYL 3）、α-原肌球蛋白基因（α-tropomyosin 1，TPM 1）、心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白C（myosin-binding protein C，MYBPC3）、結(jié)蛋白基因（desmin，DES）等基因中找到與RCM相關(guān)的變異基因[4]。其中以TNNI3、TNNT2、MYH7、ACTC基因變異為主，提示肌節(jié)蛋白變異是原發(fā)性RCM 的重要遺傳基礎(chǔ)[3]。因此對(duì)肌節(jié)蛋白相關(guān)基因進(jìn)行篩查對(duì)原發(fā)性RCM發(fā)病機(jī)制的研究有重要意義。本文主要介紹TNNI3基因。

TNNI3位于染色體19q13.4上，由8個(gè)外顯子組成，編碼心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）在心肌中表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的主要傳感器是肌鈣蛋白復(fù)合物，肌鈣蛋白復(fù)合體是心肌收縮、舒張活動(dòng)中最重要的功能成分，由肌鈣蛋白T 與肌鈣蛋白c、肌鈣蛋白Ⅰ亞基組成[3]，其主要功能是控制肌肉收縮和松弛過(guò)程中粗細(xì)纖維間的相互作用。而cTnⅠ具有抑制作用，可以抑制肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白的相互作用，抑制心肌細(xì)胞收縮[5-6]。在Ca2+結(jié)合后，肌鈣蛋白C可通過(guò)鈣離子對(duì)肌肉收縮的調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)這種抑制作用，因此肌鈣蛋白復(fù)合物的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致肌肉收縮[7]。

本研究利用全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing，WES）檢測(cè)1 例兒童可疑R CM 的致病基因，評(píng)估WES 對(duì)RCM 遺傳檢測(cè)的可行性，并分析該基因變異與RCM表型的相關(guān)性。

1 臨床資料

患兒，女性，4 歲8 個(gè)月，因咳嗽、發(fā)熱7 天，發(fā)現(xiàn)心律失常2 天就診。患兒系G1 P1，足月，剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量3 600 g?；純荷L(zhǎng)發(fā)育無(wú)異常；否認(rèn)家族遺傳性或先天性病史?；純河?019 年2 月（4 歲6 個(gè)月）上樓時(shí)有口唇發(fā)紺1次（具體情況不詳）?；純喝朐呵安噬曅膭?dòng)圖示：①全心擴(kuò)大，運(yùn)動(dòng)減弱；②心功能不全；③少量心包積液；④二尖瓣關(guān)閉不全（中量反流）；⑤肺動(dòng)脈高壓。入院前心電圖示竇性心動(dòng)過(guò)緩，雙心房負(fù)荷重，左心室高電壓，廣泛導(dǎo)聯(lián)ST 段改變，廣泛導(dǎo)聯(lián)T波改變，Q-T間期延長(zhǎng)。入院體格檢查：神清，呼吸平穩(wěn)，反應(yīng)可。全身未及明顯皮疹，淺表淋巴結(jié)未及腫大，咽稍紅，雙扁桃體無(wú)明顯腫大；雙肺呼吸音粗，可聞及痰鳴音；心音稍弱，心率78次/min，律齊，未及病理性雜音；腹軟，肝脾肋下未及；四肢肌張力可；神經(jīng)系統(tǒng)檢查無(wú)異常。入院后實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)白細(xì)胞總數(shù)8.40×109/L，血紅蛋白119 g/L，血小板總數(shù)187×109/L，中性細(xì)胞百分比59.3%，淋巴細(xì)胞百分比35.5%，中性細(xì)胞絕對(duì)值4.98×109/L，淋巴細(xì)胞絕對(duì)值2.98×109/L，C反應(yīng)蛋白28 mg/L；肌紅蛋白8.66 ng/mL，N末端腦鈉肽 1 423.86 pg/mL，肌鈣蛋白Ⅰ 0.02 ng/mL。心型脂肪酸結(jié)合蛋白0.6 ng/mL，肌酸激酶-MB同工酶 2 U/L，肌酸激酶 26 U/L，乳酸脫氫酶 235 U/L，肝腎功能、電解質(zhì)無(wú)異常?；純喝朐涸\斷：心肌?。ㄏ拗菩托募〔】赡埽瑪U(kuò)張型心肌病可能）、心功能不全Ⅱ級(jí)、肺炎。

患兒入院后完善心電圖、超聲心動(dòng)圖及冠脈CT等檢查。入院第1 天，心電圖示竇性心律，心房肥大，左室肥大，ST改變（各導(dǎo)聯(lián)ST壓低1.1～2.3 mm），T波改變（各導(dǎo)聯(lián)T 波低鈍、倒置）；超聲心動(dòng)圖示雙房顯著增大，左右室心肌疏松（右室為主），二尖瓣中重度反流，三尖瓣中度反流左心收縮功能減低（射血分?jǐn)?shù)為56%）。入院第2 天，患兒心臟冠脈CT 血管造影（cardiac coronary CT angiography）檢查示冠狀竇增粗，余冠脈未見(jiàn)明顯異常；左心室、左心房及右心房增大，心包少量積液。入院第4天，復(fù)查心電圖示竇性心律，左室肥大，ST改變（Ⅱ、Ⅲ、aVF、V5、V6導(dǎo)聯(lián)ST壓低1～2 mm），T波改變（各導(dǎo)聯(lián)T波均低鈍、倒置）；復(fù)查超聲心動(dòng)圖示心臟位置及連接正常，左房及右房顯著增大，左室內(nèi)徑增大，左右室游離壁及右室心尖部心肌疏松，肌小梁呈海綿樣增厚（右室為主），肺動(dòng)脈總干血流0.6 m/s，二尖瓣瓣環(huán)內(nèi)徑2.8 cm，血流0.8 m/s，反流中重度；三尖瓣瓣環(huán)內(nèi)徑2.3 cm，血流0.6 m/s，反流中度，反流壓差32 mmHg，沿房間隔未見(jiàn)明顯穿隔血流，室間隔連續(xù)；左位主動(dòng)脈弓，左右冠狀動(dòng)脈開(kāi)口未見(jiàn)增寬，未見(jiàn)明顯動(dòng)脈導(dǎo)管開(kāi)放，組織多普勒超聲檢測(cè)左右房室瓣環(huán)舒張?jiān)缙诔溆澹‥）與舒張晚期充盈峰（A）的比值（E/A）均＜1；動(dòng)態(tài)心電圖示竇性心律+異位（平均心率56次/min，最快心率100次/min，最慢心率41次/min），室性期前收縮76個(gè)，交界性異博28個(gè)。

入院后，患兒予地高辛強(qiáng)心，氫氯噻嗪、螺內(nèi)酯利尿，磷酸肌酸鈉營(yíng)養(yǎng)心肌，同時(shí)予卡托普利降壓，頭孢曲松抗感染。經(jīng)治療，患兒無(wú)咳嗽、氣促、面色青紫等不適，予出院并隨訪。

因根據(jù)患兒心電圖、超聲心動(dòng)圖及冠脈CT 等檢查，結(jié)合臨床表現(xiàn)，考慮心肌病可能，不能排除基因異常導(dǎo)致，故予完善全外顯子測(cè)序行基因檢測(cè)。經(jīng)上海市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患兒或父母簽署知情同意書，采集患兒及其父母的外周血2 mL，使用吸附法DNA 提取試劑盒（QⅠAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen公司，Hilden，Germany）提取基因組DNA，通過(guò)瓊脂糖電泳對(duì)樣本DNA 進(jìn)行質(zhì)測(cè)分析合格，使用Roche Nimblegen Seq Cap EZ Exome V3（羅氏）試劑盒對(duì)檢測(cè)樣本的外顯子編碼區(qū)及其上下游20 bp 區(qū)域進(jìn)行捕獲、擴(kuò)增、建庫(kù)，采用高通量測(cè)序平臺(tái)（Hiseq2500）測(cè)序。在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Ⅰnformation，NCBⅠ）網(wǎng)站下載TNNI 3基因DNA 全序列（NM_000363.4，Gene ⅠD：7137），采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物，由上海生工生物工程有限公司合成；利用PCR 試劑盒（天根生化科技有限公司）擴(kuò)增。引物序列為，F(xiàn)：5’-ACT TAG GCA TCC AGG GTA GA-3’，R：5’-GCC CTG GGT AAT AGA CAT GGA-3’。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物純化、利用 ABⅠ 3730 XL 全自動(dòng)DNA 測(cè)序儀，采用正向測(cè)序，與標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比分析基因序列，以進(jìn)一步驗(yàn)證變異基因。在HGVS 標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上與參考基因組NCBⅠ Genome（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）比對(duì)，并綜合人群頻率數(shù)據(jù)庫(kù)ExAC（http://exac.broadinstitute.org/）、千人基因組1000 Genomes Project、致病性數(shù)據(jù)庫(kù)ClinVar（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）、OMⅠM（http://www.omim.org）等進(jìn)行注釋。通過(guò)NCBⅠ Homologene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）對(duì)變異位點(diǎn)在不同物種間進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)。使用 SⅠFT、Polyphen2、Mutation Taster、Mutation Assessor等軟件對(duì)候選基因的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)，評(píng)估變異致病性。

圖1 患兒家系的 Sanger 測(cè)序圖

圖2 變異位點(diǎn)在不同物種氨基酸同源序列比對(duì)結(jié)果

通過(guò)WES 篩查，本例患兒攜帶TNNI 3（NM_000363.4）雜合變異。Sanger 測(cè)序證實(shí)，患兒父親和母親均無(wú)該變異（圖1）。該變異導(dǎo)致精氨酸變異為組氨酸。通過(guò)NCBⅠ Homologene 對(duì)TNNI 3基因192位點(diǎn)氨基酸的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在不同物種之間有高度保守性（圖2）。根據(jù)OMⅠM 數(shù)據(jù)庫(kù)、ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)和臨床表型分析，認(rèn)為該基因變異與患兒的臨床表型有關(guān)聯(lián)?；純簲y帶的TNNI 3基因c.575 G＞A（p.Arg192His）變異在GnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)均無(wú)人群頻率報(bào)道，ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)顯示既往有該變異位點(diǎn)報(bào)道，臨床意義為致?。╬athogenic）。通過(guò)PolyPhen2、SⅠFT、Mutation Taster、Mutation Assessor軟件進(jìn)行TNNI3基因c.575G＞A（p.Arg192His）變異的有害性預(yù)測(cè)。PolyPhen2預(yù)測(cè)變異評(píng)分為0.994，變異類型為很可能有害（probably damaging），多重串行比對(duì)也顯示TNNⅠ3 蛋白第192 位精氨酸殘基高度保守，說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)正常蛋白功能的表達(dá)非常重要（圖3）。SⅠFT軟件預(yù)測(cè)評(píng)分為-4.636，預(yù)測(cè)變異類型為有害的（deleterious）。Mutation Taster 軟件預(yù)測(cè)為Model：simple aae,prob:0.999100999547085，屬于致病（disease causing）。Mutation Assessor軟件預(yù)測(cè)致病性為中等（medium）。

圖3 PolyPhen2 軟件中的多重串行對(duì)比（黑框?yàn)樽儺愇稽c(diǎn)）

2 討論

通過(guò)WES發(fā)現(xiàn)本例患兒攜帶TNNI3基因c.575G＞A（p.Arg192His）雜合變異，為新發(fā)變異。該變異導(dǎo)致TNNI 3基因第192 位的精氨酸（Arg）被組氨酸（His）取代。通過(guò)氨基酸同源性序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TNNI 3基因的第192 位氨基酸殘基在不同物種間存在高度保守性。查詢ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)、OMⅠM數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)顯示均無(wú)人群頻率報(bào)道，說(shuō)明該變異相對(duì)罕見(jiàn)。ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)顯示既往有該位點(diǎn)變異報(bào)道，變異意義為致病。經(jīng)過(guò)PolyPhen2、SⅠFT、Mutation Taster等軟件預(yù)測(cè)顯示該位點(diǎn)變異很可能有害，說(shuō)明c.575G＞A變異很可能會(huì)影響TNNI3基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能。本例患兒的心電圖及超聲心動(dòng)圖均提示雙側(cè)心房增大，BNP異常增高，符合RCM的診斷。

RCM 是由編碼肌小節(jié)蛋白的基因變異導(dǎo)致的遺傳病，其中TNNI 3基因是主要的致病基因之一。TNNI3基因的相關(guān)變異會(huì)增加心肌細(xì)胞對(duì)鈣離子的敏感性、ATP 酶活性及心肌收縮力水平[4]，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。其中與本例患兒相關(guān)的TNNI3基因c.575G＞A（p.Arg192His）變異定位在蛋白質(zhì)的保守C端區(qū)域內(nèi)，位于肌動(dòng)蛋白與肌鈣蛋白Ⅰ結(jié)合區(qū)域，其機(jī)制可能是通過(guò)改變Ca2+親和力，引起心肌纖維對(duì) Ca2+的敏感性增加，造成心肌收縮力增強(qiáng)和纖維舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心肌病的發(fā)生[8-9]。除此之外，Arg192His轉(zhuǎn)基因小鼠同樣呈RCM 表型[10]，也證明了該位點(diǎn)突變與RCM相關(guān)。

2003 年報(bào)道第1 例TNNI 3基因Arg 192 His 變異病例[7]，為RCM伴陣發(fā)性房顫男性患兒，16歲時(shí)心超提示雙房重度增大，左室壁厚度正常，收縮功能正常；心電圖顯示所有導(dǎo)聯(lián)p波異常；19歲時(shí)死于心臟衰竭；期間取右心室內(nèi)膜心肌活檢顯示非特異性間質(zhì)纖維化，無(wú)心肌細(xì)胞肥大或心肌細(xì)胞紊亂；基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)TNNI3第8外顯子存在第92位上胞嘧啶核苷酸被腺嘌呤核苷酸替換，導(dǎo)致Arg192His氨基酸替換；這種變異在患兒父母中都不存在。另1例TNNI3Arg192His變異導(dǎo)致左心室心肌致密不全病例為女性患兒，13歲時(shí)學(xué)校體檢發(fā)現(xiàn)心電圖異常，后出現(xiàn)呼吸困難與暈厥等；期間超聲心動(dòng)圖及心肌內(nèi)膜活檢均提示左心室心肌致密不全；基因檢測(cè)提示TNNI 3雜合錯(cuò)義變異575G＞A（p.Arg192His）；15歲時(shí)因室顫導(dǎo)致心臟性猝死[8]。還曾在一家系中發(fā)現(xiàn)TNNI36467G＞A（p.Arg192His）變異，先證者7歲起就有心力衰竭，并伴有漸進(jìn)性疲勞和呼吸困難；超聲心動(dòng)圖顯示雙房增大，左室肥厚不對(duì)稱，最大左室壁厚17 mm，左室收縮功能正常，充盈受限；心導(dǎo)管檢查顯示肺動(dòng)脈壓無(wú)異常；先證者16歲時(shí)心臟性猝死；先證者父親29歲時(shí)患充血性心力衰竭，后期診斷為RCM，47歲時(shí)死于多器官功能障礙；先證者姐姐10歲時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)心力衰竭，4次暈厥發(fā)作，最終也被診斷為RCM，且于16歲時(shí)心臟性猝死[11]。

由TNNI3的575G＞A（p.Arg192His）基因變異導(dǎo)致的心肌致密化不全，RCM等各種不同心臟病，最終導(dǎo)致心力衰竭，預(yù)后差，猝死率高，需要起搏器植入或心臟移植治療。TNNI3Arg192His變異可為家族性遺傳，但本例患兒為散發(fā)性變異，父母均無(wú)該變異，且年齡僅有4歲8月齡，早于既往報(bào)道病例。本例患兒經(jīng)過(guò)對(duì)癥治療后好轉(zhuǎn)出院，但仍需門診隨訪評(píng)估心臟損害程 度。

綜上，RCM的臨床診斷為排他性診斷，需除外肥厚型心肌病、瓣膜性心臟病、心包疾病和先天性心臟病等。由于RCM 患兒臨床癥狀及輔助檢查結(jié)果常不典型，故全外顯子測(cè)序可為RCM 遺傳學(xué)診斷及基因治療提供方向。