干擾LINC00308促進(jìn)miR-634對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

魏仁波 張唯力 卓暉 楊鎰魟 熊黎強(qiáng) 楊鵬 魏武然 曹敏

(1.成都市第三人民醫(yī)院泌尿外科,四川 成都 610031；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科,重慶 400010；3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院男科,四川 成都 610041；4.成都市第三人民醫(yī)院病理科,四川 成都 610031；5.四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科,四川 成都 610041)

前列腺癌是男性常見(jiàn)癌癥，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。在大多數(shù)國(guó)家或地區(qū)，新診斷出的前列腺癌病例數(shù)正在增加[2-3]。盡管目前擁有早期前列腺癌患者的治療選擇(例如手術(shù)、激素治療和放射療法等)，但對(duì)于晚期疾病患者，其5年生存率仍然很低[4]。因此，有必要描述前列腺癌發(fā)展中涉及的分子機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)新穎的和重要的潛在診斷標(biāo)志物與治療靶標(biāo)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)曾經(jīng)被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄噪聲，然而，它在各種水平上發(fā)揮著重要的功能，如X染色體失活，染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄抑制[5]，影響包括前列腺癌在內(nèi)的許多不同癌癥類型的生物學(xué)功能。據(jù)報(bào)道，LINC00308在前列腺癌中高表達(dá)，是前列腺癌發(fā)生的重要因素[7]。但是，LINC00308在前列腺癌中的生物學(xué)功能和潛在機(jī)制仍然難以捉摸。微小RNA(microRNA，miRNA)是由19-25個(gè)核苷酸組成的小型非編碼RNA，可通過(guò)對(duì)其靶mRNA的負(fù)調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程[8]，它們已被確定為癌基因或抑癌基因來(lái)影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。作為一種新型的腫瘤抑制因子，miR-634可以抑制子宮頸癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[9]。miR-634在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯低于正常鄰近組織和對(duì)照細(xì)胞，其過(guò)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[10]。迄今為止，LINC00308對(duì)miR-634調(diào)控的作用尚不清楚。因此，本研究探討了LINC00308和miR-634對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及二者的靶向關(guān)系，為前列腺癌發(fā)病機(jī)制研究提供新的見(jiàn)解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集了33例于2017年2月～2017年11月，在本院經(jīng)手術(shù)切除的前列腺癌和相鄰的無(wú)腫瘤組織標(biāo)本。所有病例均經(jīng)病理學(xué)診斷確診，并且獲得標(biāo)本手術(shù)前未進(jìn)行任何化學(xué)療法，放射療法或其他前列腺癌治療方法。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得所有患者的知情同意。將前列腺癌組織和癌旁組織立即置于液氮中，提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 前列腺癌細(xì)胞系PC-3M和DU145購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、兔抗細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki67(Nuclear associated antigen Ki67，Ki67)抗體、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，針對(duì)LINC00308的小干擾RNA(LINC00308 siRNA，si-LINC00308)、小干擾RNA陰性對(duì)照si-NC、miR-634 mimic、陰性對(duì)照miR-NC購(gòu)自上海GenePharma公司，磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京KeyGen公司，細(xì)胞周期分析試劑盒購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將PC-3M和DU145細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并保持在37℃、5% CO2的潮濕氣氛中生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前一天在24孔板中接種PC-3M和DU145細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Lipofectamine 2000將si-LINC00308或si-NC(100 nM)、miR-634 mimic、miR-NC轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后4 h，用完全RPMI 1640培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染后，在4℃下12 000×g離心15 min后收集細(xì)胞，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)效率。

1.2.2 qRT-PCR 為了檢測(cè)LINC00308、miR-634表達(dá)，使用Trizol試劑從前列腺癌組織或轉(zhuǎn)染后的PC-3M和DU145細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)制造商的規(guī)程，使用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后使用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。所用引物如下：LINC00308 5′-CAGATAAGACTCTGTCTACCCT-3′(正向)和5′-ACTGAATAAAGGAATGATGCGT-3′(反向)；GAPDH 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′(正向)和5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′(反向)；miR-634 5′-CAGTCTCAAACCAGCACC-3′(正向)和5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′(反向)；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正向)和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向)。其中GAPDH、U6用作內(nèi)源性對(duì)照。所有樣品均在ABI 7900實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)運(yùn)行。使用2-ΔΔCt公式進(jìn)行LINC00308、miR-634相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算。

1.2.3 細(xì)胞增殖分析 以細(xì)胞周期反映細(xì)胞的增殖能力。收集轉(zhuǎn)染后的PC-3M和DU145細(xì)胞，在4℃的70%冷乙醇中固定4 h。用冷磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌細(xì)胞兩次，并在37℃黑暗中用含有100 mg/mL PI和20 mg/mL RNase A的溶液染色30 min。使用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，并使用FlowJ軟件對(duì)細(xì)胞周期分布進(jìn)行定量。

1.2.4 細(xì)胞凋亡評(píng)估 根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC-3M和DU145細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染后的PC-3M和DU145細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，然后懸浮于500 μL含有Annexin V-FITC(5 μL)和PI染色溶液中。在黑暗中孵育30 min后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。早期細(xì)胞凋亡由Annexin V+/PI-定義，晚期細(xì)胞凋亡由Annexin V+/PI+染色定義，細(xì)胞凋亡率為早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞之和。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)LINC00308的潛在靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)LINC00308與miR-634部分堿基可形成互補(bǔ)配對(duì)。分別合成包含二者結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT)或突變型(MUT)LINC00308序列，并將其克隆到pmirGLO熒光素酶載體中，以生成WT-LINC00308或MUT-LINC00308。轉(zhuǎn)染前24 h，將PC-3M細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到24孔板中。使用Lipofectamine 2000將PC-3M細(xì)胞與miR-634 mimic或miR-NC和WT-LINC00308或MUT-LINC00308共轉(zhuǎn)染。48 h后，用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot) 對(duì)于Ki67、Caspase3蛋白水平檢測(cè)，使用RIPA緩沖液分離轉(zhuǎn)染后的PC-3M和DU145細(xì)胞的總蛋白，并使用雙辛可寧酸蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量。通過(guò)SDS-PAGE分離20 μg蛋白質(zhì)裂解物，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，用5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，與所需的一抗在4℃孵育過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的二抗在室溫下以1∶5000的稀釋度孵育1 h。洗滌后，用ECL試劑可視化目標(biāo)蛋白條帶，使用Quantity One軟件通過(guò)光密度測(cè)定法定量蛋白水平。其中，Ki67、Caspase3和參照蛋白GAPDH的抗體均為1：1000稀釋。

2 結(jié)果

2.1 LINC00308在前列腺癌中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)33例前列腺癌標(biāo)本中LINC00308的表達(dá)情況，見(jiàn)表1，數(shù)據(jù)顯示，LINC00308在前列腺癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌旁組織(P<0.05)。

表1 LINC00308在前列腺癌中的表達(dá)

2.2 干擾LINC00308對(duì)PC-3M和DU145增殖凋亡的影響 qRT-PCR檢測(cè)LINC00308、miR-634的表達(dá)(表2、表3)，發(fā)現(xiàn)與si-NC組相比，干擾LINC00308明顯降低PC-3M和DU145細(xì)胞中LINC00308的表達(dá)水平，顯著提高miR-634的表達(dá)水平(P<0.05)。對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示(表2、表3)，與si-NC組相比，干擾LINC00308明顯增加PC-3M和DU145細(xì)胞的G0-G1期細(xì)胞比例，顯著減少S期細(xì)胞比例(P<0.05)，而G2-M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P>0.05)。對(duì)細(xì)胞凋亡的測(cè)定結(jié)果表明(圖1、表2、表3)，干擾LINC00308后，PC-3M和DU145細(xì)胞的凋亡率明顯高于si-NC組(P<0.05)。

表2 干擾LINC00308對(duì)PC-3M增殖凋亡的影響

表3 干擾LINC00308對(duì)DU145增殖凋亡的影響

圖1 干擾LINC00308對(duì)PC-3M和DU145凋亡的影響

2.3 LINC00308靶向miR-634 生物信息學(xué)軟件對(duì)LINC00308與miR-634的結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖2)，結(jié)果顯示，二者存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果表明(表4)，與miR-NC組相比，miR-634組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LINC00308的PC-3M細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，轉(zhuǎn)染MUT-LINC00308的細(xì)胞熒光素酶活性變化不顯著(P>0.05)。

圖2 LINC00308靶向miR-634

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4 miR-634對(duì)PC-3M和DU145增殖凋亡的影響 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-634 mimic的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-634 mimic明顯提高PC-3M和DU145細(xì)胞中miR-634的表達(dá)水平(P<0.05)。對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-634 mimic明顯增加PC-3M和DU145細(xì)胞的G0-G1期細(xì)胞比例，顯著減少S期細(xì)胞比例(P<0.05)，而G2-M期細(xì)胞比例無(wú)顯著變化(P>0.05)。對(duì)細(xì)胞凋亡的分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-634 mimic后，PC-3M和DU145細(xì)胞的凋亡率明顯高于miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表5、表6。

圖3 miR-634對(duì)PC-3M和DU145凋亡的影響

表5 miR-634對(duì)PC-3M增殖凋亡的影響

表6 miR-634對(duì)DU145增殖凋亡的影響

2.5 Western Blot檢測(cè)Ki67、Caspase3蛋白的表達(dá) Western Blot檢測(cè)Ki67、Caspase3蛋白的表達(dá)(圖4、表7)，結(jié)果顯示，與si-NC組相比，干擾LINC00308明顯降低PC-3M和DU145細(xì)胞的Ki67蛋白水平，和顯著提高Caspase3蛋白水平(P<0.05)；與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-634 mimic明顯降低PC-3M和DU145細(xì)胞的Ki67蛋白水平，并顯著提高Caspase3蛋白水平(P<0.05)。

圖4 PC-3M和DU145中Ki67、Caspase3蛋白的表達(dá)

表7 Ki67、Caspase3蛋白的表達(dá)

3 討論

前列腺癌是男性的主要健康問(wèn)題，目前盡管早期診斷和治療策略的發(fā)展取得了許多進(jìn)展，但前列腺癌仍然是一種致死性疾病[11-12]。因此，迫切需要探索導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生的調(diào)控機(jī)制，這將有助于確定新的治療靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)有效的治療方法[13]。這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明，LINC00308在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，干擾其表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞的進(jìn)展，其作用機(jī)制與靶向miR-634有關(guān)。

lncRNA代表一類新型的非編碼RNA，其長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，并且不具有蛋白質(zhì)編碼潛[14]。最近，發(fā)現(xiàn)lncRNA在癌癥中失調(diào)和參與各種癌癥的生物過(guò)程，如增殖，細(xì)胞凋亡，遷移和侵襲[15-16]。在以前的研究中，LINC00308被發(fā)現(xiàn)參與了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展，LINC00308在前列腺癌患者中表達(dá)上調(diào)[17]。但LINC00308對(duì)前列腺癌發(fā)展的功能作用尚需進(jìn)一步研究。在本項(xiàng)研究中，觀察到了與之前報(bào)道[7,17]相同的結(jié)果，LINC00308在33例前列腺癌組織中異常增加，這表明了LINC00308作為該疾病的致癌lncRNA的可能作用。為了確定LINC00308的詳細(xì)功能，本實(shí)驗(yàn)利用小干擾RNA技術(shù)在前列腺癌細(xì)胞中干擾LINC00308的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-LINC00308后，PC-3M和DU145細(xì)胞中LINC00308的表達(dá)水平被下調(diào)，說(shuō)明成功構(gòu)建干擾LINC00308表達(dá)的細(xì)胞。隨后本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，干擾LINC00308顯著提高PC-3M和DU145細(xì)胞的G0-G1期細(xì)胞比例，降低S期細(xì)胞比例和增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)，并且增加了細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達(dá)水平，這表明干擾LINC00308的表達(dá)通過(guò)阻滯前列腺癌的細(xì)胞周期于G0-G1期來(lái)抑制癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，這意味著干擾LINC00308可以抑制前列腺癌的發(fā)展。

值得注意的是，miR-634已被鑒定為人類癌癥中的腫瘤抑制因子[18]。胰腺癌組織和細(xì)胞系中的miR-634表達(dá)水平顯著下調(diào)，miR-634在胰腺癌細(xì)胞中的異位過(guò)表達(dá)抑制了腫瘤的進(jìn)展[19]。與正常腦組織相比，miR-634在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中被下調(diào)，并且其表達(dá)與腫瘤大小和WHO分級(jí)相關(guān)[20]。miR-634通過(guò)靶向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)降低人乳腺癌細(xì)胞的放射抵抗力[21]。本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體用miR-634 mimic轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3M和DU145細(xì)胞，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后miR-634 mimic的表達(dá)水平被上調(diào)，提示轉(zhuǎn)染有效。繼續(xù)探索miR-634在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-634的過(guò)表達(dá)可以增加PC-3M和DU145細(xì)胞的G0-G1期細(xì)胞比例、凋亡率和Caspase3蛋白水平，明顯減少S期細(xì)胞比例和Ki67蛋白水平，這說(shuō)明miR-634能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞G0-G1期阻滯，及誘導(dǎo)其凋亡，顯示出一定的抗前列腺癌功能。

新興證據(jù)表明，lncRNA通過(guò)海綿狀miRNA充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)[22-23]。例如lncRNA DANCR作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA，通過(guò)在膠質(zhì)瘤中海綿化miR-634來(lái)調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[24]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)了與LINC00308具有互補(bǔ)堿基配對(duì)的miRNA，篩選出潛在的靶基因miR-634。在細(xì)胞功能測(cè)定中，檢測(cè)到干擾LINC00308可以提高前列腺癌細(xì)胞內(nèi)miR-634的表達(dá)水平。并且，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了LINC00308對(duì)miR-634的靶向調(diào)控，這些結(jié)果說(shuō)明miR-634是LINC00308的功能性靶基因，結(jié)合前述結(jié)果，提示干擾LINC00308抗前列腺癌的功能是通過(guò)上調(diào)miR-634的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論與啟示

本研究顯示，前列腺癌患者中LINC00308異常升高，而干擾LINC00308的表達(dá)抑制了前列腺癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。另外，miR-634是介導(dǎo)上述LINC00308功能的相關(guān)miRNA，即干擾LINC00308通過(guò)促進(jìn)miR-634的表達(dá)影響前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡。這一結(jié)果提示LINC00308可作為前列腺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。