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    miRNA-141通過調(diào)節(jié)TLR4信號通路抑制大鼠血栓形成*

    2021-02-26 13:54:20馮琦徐超孫明慧
    西部醫(yī)學 2021年2期
    關(guān)鍵詞:旁路動靜脈血漿

    馮琦 徐超 孫明慧

    (新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院腎病科,新疆 烏魯木齊 830011)

    血栓形成是影響心血管健康的重要原因,血小板被活化后發(fā)生黏附和聚集是動脈血栓形成的關(guān)鍵因素[1]。目前,針對血栓已有大量集中于微小RNA(miRNA)作為診斷和治療靶點的研究,并提出了有效的治療方法[2],如外周血單個核細胞miR-483-3p聯(lián)合血漿D-二聚體檢測可作為診斷下肢深靜脈血栓的參考指標[3]。另外,血清miRNA-208與血小板活化密切相關(guān),而且miRNA-208參與了血小板活化的調(diào)控[4]。研究表明血漿中循環(huán)的miRNA對血栓的診斷價值,并證實了它們與高凝性標志物的相關(guān)性[5]。Toll-like受體(TLR)是由10種不同的受體組成的家族,可識別病原體中的保守序列,主要受體被認為是Toll-like受體2(TLR2)和Toll-like受體4(TLR4),其可誘導多種細胞因子的分泌并因此介導炎性反應[6]。多項研究已經(jīng)探明TLR4信號對血管疾病和血栓治療的重要性[7]。研究表明TLR4可被多種miRNA調(diào)控[8]。miR-141被發(fā)現(xiàn)可作為一種調(diào)節(jié)腫瘤血栓的潛在標志物[9],與炎癥調(diào)節(jié)密切相關(guān)的miR-141對血栓的調(diào)節(jié)和對TLR4信號的調(diào)控作用較少[10]。通過本研究,我們建立血栓大鼠模型并基于TLR4信號通路旨在探明miR-141的表達對血栓形成的作用。

    1 材料與方法

    1.1 動物 SPF級別SD大鼠,雄性,體重178~231 g,購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。本研究中涉及到的動物實驗均通過我院倫理委員會審批通過。

    1.2 試劑 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購于美國亞什蘭BlanoseTM公司;阿司匹林購于上海復旦大學醫(yī)藥藥劑科;6-酮-前列腺素F1(6-keto-PGF1)試劑盒,購于軍事醫(yī)學科學院同位素室;cGMP試劑盒購于上海中醫(yī)藥大學同位素室;NO試劑盒購于南京建成生物工程研究所。pcDNA3.1-TLR4重組質(zhì)粒、miR-141的擬似物mimic、mimic的陰性對照(mimic-NC)均購買于上海吉瑪生物科技有限公司。TLR4的一抗(ab13556),兔抗NF-κB(ab101898),兔抗Rsc1(ab155938),兔抗IL-1β(ab106035)和兔抗GAPDH(ab9485),IgG二抗(ab6721)均購買于美國Abcam公司。電化學發(fā)光(ECL)試劑購于南京碧云天生物科技公司。

    1.3 實驗分組和動物給藥 90只SD雄性大鼠隨機分組,其中10只為正常對照組;模型組使用5 g/L的CMC-Na建立大鼠動靜脈旁路血栓模型(20只);治療組在CMC-Na基礎(chǔ)上分別靜脈注射100 mg/kg阿司匹林(Asp)作為陽性對照(10只)、miR-141的擬似物mimic(20只)、mimic陰性對照mimic-NC(10只)、mimic聯(lián)合Toll樣受體4(TLR4)過表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TLR4(mimic+pcDNA3.1-TLR4)(20只)。藥物均用5 g/L的CMC-Na溶液制成混懸液,給藥體積為10 mL/kg,靜脈給藥,每日1次連續(xù)4周。

    1.4 頸動靜脈旁路血栓模型 依據(jù)文獻建立頸動靜脈旁路血栓模型[11]。末次給藥1 h后,大鼠進行頸動靜脈旁路血栓形成實驗。將大鼠麻醉(戊巴比妥鈉30~40 mg/Kg,腹腔注射),分離右頸總動脈及左頸外靜脈,在聚乙烯管中段放入一根長6 cm的絲線,以肝素生理鹽水溶液(50 Um/L),充滿聚乙烯管。當聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后, 由聚乙烯管準確的注入肝素(50 μM/L)抗凝, 隨后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈,打開動脈夾,血液從右頸總動脈流至聚乙烯管,返回左頸外靜脈,開放血流15 min后中斷血流,迅速取出絲線稱重, 總重量減去絲線重量即得血栓重量。同時計算出血栓抑制率。血栓抑制率(%)=(模型血栓濕重-治療組血栓濕重)/模型組血栓濕重×100%[12]。

    1.5 血漿中NO,cGMP,PGI2水平的測定 取頸動靜脈旁路血栓形成實驗中的大鼠,下腔靜脈取血1 mL,EDTA抗凝。按試劑盒說明采用放免法測定cGMP和PGI2,分光光度法測定NO。

    1.6 體外血小板聚集實驗 取給藥大鼠,末次給藥1 h后麻醉大鼠,腹主動脈取血0.5 mL, 肝素(20 μM/L)抗凝,分離富血小板血漿(PRP),將PRP中血小板數(shù)調(diào)整為3×1011/L, 用改良Born比濁法測定血小板聚集性。取200 μL PRP,37℃溫育5 min后,二磷酸腺苷組(ADP組)加入200 μmol/L的ADP 3 μL,mimic組為在血小板加入200 μmol/L ADP后并同時加入mimic,mimic-NC組為在血小板加入等量ADP并同時加入mimic-NC,加入記錄5 min血小板的聚集曲線[13]。聚集抑制率按下列公式計算:血小板聚集抑制率(%)=(模型組最大聚集率-治療組最大聚集率/模型最大聚集率)×100%[14]。

    1.7 蛋白免疫印跡 將補充有液氮的大鼠靜脈組織研磨為粉末,隨后加入裂解緩沖液。4℃離心(1200 rpm)后,收集上清液。隨后通過Bradford分析鑒定蛋白質(zhì)濃度。隨后將提取的蛋白質(zhì)與2×上樣量與蛋白質(zhì)相同的上樣緩沖液充分混合。將混合物在100℃加熱5min后,使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)樣品(20 μg/泳道)電泳分離。隨后使用全濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在室溫下,將PVDF膜在1×Tris緩沖液中用Tween 20孵育并密封45 min。兔抗TLR4的一抗(1∶1000),兔抗NF-κB(1∶200),兔抗Rsc1(1∶1000),兔抗IL-1β(1∶2000)和兔抗GAPDH(1∶2500)加入到PVDF膜中,隨后在4℃下孵育過夜。在使用TBST清洗3次(每次5 min)后,在PVDF膜上添加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000)在室溫下孵育2小時。TBST漂洗(每次洗滌5min)3次,隨后使用增強的電化學發(fā)光(ECL)試劑(Beyotime Biotechnology,南京,中國)進行顯色。將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參蛋白,目標條帶與內(nèi)參的灰度值之比代表蛋白的相對表達。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-141對血栓模型的影響 miR-141的mimic組的血栓濕重與模型組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。mimic組與模型組比較上調(diào)血漿中NO,PGI2水平(P<0.01和P<0.001),mimic組提高血漿中cGMP水平(P<0.01),差異均有統(tǒng)計學意義。陽性對照組的血栓濕重與模型組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陽性對照組與模型組比較上調(diào)血漿中NO,PGI2水平(P<0.05和P<0.05),陽性對照組提高血漿中cGMP水平(P<0.01),差異均有統(tǒng)計學意義。mimic與陽性對照組相比,mimic組的血栓濕重明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。mimic組上調(diào)血漿中NO,PGI2水平(P<0.05和P<0.05),mimic組提高血漿中cGMP水平。差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1、2。

    表1 miR-141對大鼠動靜脈旁路血栓的抑制作用

    表2 miR-141對大鼠血漿中NO,PGI2,cGMP水平的影響

    2.2 miR-141對體外血小板聚集的影響 過表達miR-141對血小板聚集的影響如表3所示,mimic組抑制由ADP誘導的血小板聚集,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

    表3 miR-141對ADP誘導的血小板凝聚的作用

    2.3 miR-141對血栓模型大鼠頸靜脈組織中TLR4信號的影響 與模型組比,miR-141的mimic組TLR4(P<0.01),NF-κB(P<0.01),Rac1(P<0.01),IL-1β(P<0.01)的表達水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義;與模型組比,陽性對照組TLR4(P>0.05),NF-κB(P>0.05),Rac1(P>0.05),IL-1β(P>0.05)的表達水平差異,差異無統(tǒng)計學意義,見圖1。

    2.4 過表達TLR4逆轉(zhuǎn)miR-141對血栓的抑制 與mimic組比,mimic+pcDNA3.1-TLR4組的TLR4(P<0.05),NF-κB(P<0.05),Rac1(P<0.05),IL-1β(P<0.05)的表達水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義,見圖1;與mimic組比,mimic+pcDNA3.1-TLR4組的血栓濕重明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。與mimic組比,mimic+pcDNA3.1-TLR4組血漿中NO,PGI2水平下調(diào)(P<0.05和P<0.05),與mimic組比,mimic+pcDNA3.1-TLR4組的血漿中cGMP水平下調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4。

    表4 過表達TLR4逆轉(zhuǎn)miR-141對血栓的抑制

    圖1 蛋白免疫印跡法檢測miR-141對TLR4,NF-κB,Rac1,IL-1β的蛋白表達水平的影響

    3 討論

    血管旁路血栓的形成及其并發(fā)癥通常會增加住院患者的不良處境[15]。血栓形成發(fā)病機制涉及多種復雜因素,并且多種遺傳因素已被證明與頸動靜脈旁路血栓的形成和發(fā)展有關(guān)[16]。在我們的研究中,miR-141可以通過抑制TLR4信號通路來抑制抑制頸動靜脈旁路血栓的形成。

    通過使用生物學預測網(wǎng)站microRNA.org的預測分析發(fā)現(xiàn)miR-141可能與TLR4具有靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。研究表明,TLR4已被證實直接被miR-21靶向抑制[17],并且miR-335通過調(diào)節(jié)TLR4介導患的靜脈血栓形成[18]。在先前的研究中,miR-141在3′UTR中靶向骨形成蛋白2并調(diào)節(jié)其表達,從而對成骨分化的調(diào)控[19]。而針對miR-141和TLR4之間關(guān)系的研究較少。

    本研究發(fā)現(xiàn)miR-141下調(diào)頸動靜脈旁路血栓的形成大鼠TLR4信號通路相關(guān)基因(NF-κB,Rac1和IL-1β)的表達。TLRs包含一類蛋白質(zhì),可以識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)并激活宿主先天免疫的反應[20],因此,多項研究聚焦于TLRs對癌和炎癥的調(diào)節(jié)機制[21]。多項研究結(jié)果一致表明,動脈粥樣硬化患者中TLR4的表達較高,而miR-146可以抑制動脈粥樣硬化患者中TLR4信號的激活以及血管炎性損傷[22]。事實證明,TLR信號可以被miRNA調(diào)節(jié),例如,在Jiang等人的先前研究中,miR-26a通過靶向大鼠巨噬細胞中的TLR3自身來負向調(diào)節(jié)TLR3信號,從而減輕了類風濕性關(guān)節(jié)炎[23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)通過過表達miR-141,血栓大鼠血管組織中的TLR4表達顯著下調(diào)。而且通過恢復TLR4的表達,NF-κB,Rac1和IL-1β的表達被恢復的同時,miR-141對血栓多項相關(guān)指標也被明顯逆轉(zhuǎn)。在Schattner等人的研究中,TLR4是心血管疾病血栓形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[24]。因此,TLR4誘導的血管細胞炎癥與血細胞的粘附相關(guān),這可能是miR-141通過調(diào)節(jié)TLR4信號抑制血栓形成的關(guān)鍵機制。

    此外,我們證明,與模型組相比,miR-141 mimic減少了血栓的濕重,但升高血漿中NO,PGI2,cGMP水平。血小板聚集在新的血栓形成中起重要作用[25]。血栓中較高的血小板數(shù)量可阻斷血液通暢性并誘導血栓形成[26]。而且最新的研究同樣表明miR-141能夠抑制細胞的增殖和粘附[27-28]。另外,我們的實驗不僅證實miR-141顯著地抑制大鼠頸動靜脈旁路血栓的形成,提高NO,cGMP,PGI2水平,抑制血小板聚集,而且發(fā)現(xiàn)miR-141 mimic的作用優(yōu)于阿司匹林。目前已知NO,cGMP,PGI2都與血栓的形成有關(guān)。NO作為一種信使分子,具有抗血小板聚集,抗血小板和血細胞粘附作用。其作用機制是經(jīng)NO/cGMP代謝通路,使血小板內(nèi)cGMP升高,通過cGMP的第二信使作用,調(diào)節(jié)收縮蛋白質(zhì)磷酸化水平,并使細胞內(nèi)Ca2+水平降低,抑制血小板的聚集從而減少血栓的形成[29]。前列環(huán)素(PGI2)在心血管系統(tǒng)中具有保護作用,它能擴張血管,抑制血小板聚集,并可拮抗性減少血栓素的含量,而后者是已知最強的血小板聚集劑。PGI2與TXA2的比值對于心血管系統(tǒng)生理功能的穩(wěn)定與調(diào)節(jié)至關(guān)重要[30-31]。本實驗證實,過表達miR-141可以同時升高NO,cGMP,PGI2水平,通過影響NO/cGMP代謝通路及改變PGI2的水平而抑制血小板聚集,發(fā)揮抑制血栓形成作用。我們的研究結(jié)果為以后血栓治療的靶向藥物開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

    4 結(jié)論

    miR-141的過表達可以減少血栓形成,我們對機制研究表明,miR-141可通過抑制TLR4信號通路改善頸動靜脈旁路血栓的形成。

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