紫紅曲霉鑒定及兩階段培養(yǎng)產多糖條件優(yōu)化

余慧菁 蔣詠梅 章文賢

摘 要：采用形態(tài)學特征及ITS序列分析對已篩選的菌株進行鑒定。為優(yōu)化振蕩靜置兩階段培養(yǎng)紅曲霉產胞內多糖的條件，分別測定了搖瓶過程中菌絲球數(shù)量、發(fā)酵液黏度、pH和殘?zhí)呛?，以及靜置培養(yǎng)中菌絲體生物量、內多糖的含量和產量。結果表明：紫紅曲霉在振蕩培養(yǎng)3 d后再靜置培養(yǎng)6 d的條件下，菌絲球大小適中，生物量較高，發(fā)酵液黏度低，傳質效果好，pH中性，紅曲霉內多糖含量和產量均達到最高值，分別為18.9 mg·g-1和138.9 mg·L-1。

關鍵詞：紫紅曲霉;內多糖;液態(tài)靜置發(fā)酵;工藝條件

中圖分類號：TQ 925.1? 文獻標志碼：A? 文章編號：0253-2301（2021）12-0032-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.006

Identification of Monascus Purpureus and Optimization of the Conditions forPolysaccharide Production in the Two-stage Culture

YU Hui-jing1， JIANG Yong-mei1， ZHANG Wen-xian1，2*

（1. College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Engineering Research

Center of Ministry of Education of Industrial Microbiology， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： The morphological characteristics and ITS sequence analysis were used to identify the screened strains. In order to optimize the conditions for the production of intracellular polysaccharides from Monascus in the two stages of oscillating and static culture， the number of mycelium pellets， the viscosity of fermentation broth， pH and the content of residual sugar during the process of shake flask were determined， as well as the biomass of mycelia， the content and yield of intracellular polysaccharides in the static culture. The results showed that under the conditions of oscillating culture for 3 d and then static culture for 6 d， Monascus purpureus had moderate size of mycelium pellets， high biomass， low viscosity of fermentation broth， good mass transfer effect and neutral pH. The content and yield of intracellular polysaccharides in Monascus reached the highest values， which were 18.9 mg·g-1and 138.9 mg·g-1， respectively.

Key words： Monascus purpureus; Intracellular polysaccharides; Liquid static fermentation; Process conditions

紅曲霉，在分類學上被劃分為半子囊菌，屬于子囊菌類的絲狀真菌。目前為止，已經確定了大約20個菌株[1]。由紅曲霉發(fā)酵制成的中藥紅曲藥食同源，具有健脾消食，活血化瘀，以及降血糖、降血脂、降血壓的功效[2]。據(jù)報道，紅曲霉中含有多種次級代謝產物，如莫納克林K、紅曲色素、γ-氨基丁酸、紅曲多糖等[3]，在食品、醫(yī)藥、化工方面均有廣泛的應用[4]。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)紅曲多糖具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力等生物學活性[5]，因此國內外很多學者對其進行了系列研究。蔣汶等[6]采用紫外結合常壓室溫等離子體復合誘變方法對紅曲霉菌株進行誘變，篩選出比原始菌株產外多糖能力強且具有良好遺傳穩(wěn)定性的突變菌株。伍健萍等[7]調整了紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產胞外多糖的條件，得到適合產胞外多糖的培養(yǎng)基配方。李月嬋等[8]對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產胞外多糖的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并初步研究了其抗氧化性和抑菌性。2014年，汪鵬榮等[9]通過Box-Behnken設計優(yōu)化胞內多糖的提取條件。2021年，Wang等[10]在堿性條件下從紅曲菌絲體中提取胞內多糖，成功將其分離為4個亞組分，并對其進行系統(tǒng)描述。以上研究大多集中于胞外多糖的工藝優(yōu)化，對胞內多糖的研究較少。然而，研究表明，紅曲霉胞內多糖同樣含有抗氧化、抗腫瘤和提高免疫力的作用。

目前主要采用液體振蕩發(fā)酵法培養(yǎng)紅曲霉，尚未有人探究過振蕩結合靜置的兩階段培養(yǎng)方式。有報道表明，兩階段培養(yǎng)法廣泛應用于靈芝菌絲體的培養(yǎng)，并有效地提高了靈芝酸的含量[11]。因此，本試驗以紫紅曲霉為材料，采用液態(tài)深層搖瓶-靜置兩階段培養(yǎng)方式合成紅曲胞內多糖，通過分析培養(yǎng)過程中的相關指標的變化，確定紫紅曲霉產生胞內多糖的最佳培養(yǎng)條件，以期為紅曲內多糖的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗藥劑

試驗材料為紅曲米（購自福建省大田縣）。試驗藥劑主要有：葡萄糖、瓊脂、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、蛋白胨、酵母精粉、5%苯酚、濃硫酸。

1.2 試驗主要儀器

恒溫恒濕箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺、恒溫數(shù)顯水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、奧式粘度計、pH計、電鼓風干燥箱、生物傳感分析儀、電子分析天平、渦旋混合器、紫外可見分光光度計。

1.3 培養(yǎng)基的配制

1.3.1 PDA固體培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，七水硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，維生素B1 0.05 g，去離子水1 L，自然pH，121℃滅菌20 min。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖 35 g，蛋白胨5 g，酵母精粉2.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1 g，維生素B1 0.05 g，去離子水1 L，自然pH，121℃滅菌20 min。

1.3.3 深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖35 g，蛋白胨5 g，酵母精粉 5 g，七水硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1 g，維生素B1 0.05 g，去離子水1 L，自然pH，121℃滅菌20 min。1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌株分離 取5 g紅曲米在無菌超凈臺中研磨成粉，加入45 mL無菌水，充分搖勻。梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4倍[12]，涂布分離于 PDA平板，30℃培養(yǎng)2～

6 d，待長出白色菌絲。用接種環(huán)挑取白色菌絲，在平板上劃線[13]，直到早期產生白色菌落，后期為紅色或紫色的單菌落，再純化培養(yǎng)[14]。

1.4.2 菌株活化 接種環(huán)挑取菌種至斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)6～7 d，待菌絲長滿斜面。

1.4.3 一級種子液體培養(yǎng) 移液槍吸取10 mL無菌水加入長滿菌絲的斜面，接種鏟刮下白色菌絲倒入40 mL一級種子培養(yǎng)基中，恒溫搖床（30℃、120 r·min-1）培養(yǎng)2 d。

1.4.4 二級種子液體培養(yǎng) 培養(yǎng)2 d的一級種子液倒入滅菌的裝有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩打碎菌絲，吸取5 mL菌絲液至45 mL二級種子培養(yǎng)基中，30℃、120 r·min-1搖瓶培養(yǎng)1 d。

1.4.5 液體深層發(fā)酵培養(yǎng) 二級種子液菌絲打碎后，以10%的接種量接入180 mL的液體培養(yǎng)基，30℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)。

1.4.6 液體靜置培養(yǎng) 深層發(fā)酵培養(yǎng)結束，倒入培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)。

1.5 測定方法

1.5.1 紅曲霉菌株鑒定 菌株測序得到ITS序列。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫上紅曲霉的序列進行比對，選擇同源性較高的序列用MEGA 6按照鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，經Bootstrap重復構建循環(huán)1000次[15]。系統(tǒng)發(fā)育樹按比例繪制，其分支長度與用來推斷系統(tǒng)發(fā)育樹的進化距離的單位相同。進化距離用Kimura雙參數(shù)方法計算，以每個位點堿基替換的數(shù)量為單位。

1.5.2 菌絲球數(shù)量測定 移液器吸取10 mL深層發(fā)酵液，稀釋并計數(shù)。

1.5.3 發(fā)酵液黏度的測定 采用奧式粘度計測定。

1.5.4 pH和殘?zhí)堑臏y定 采用PHS3C型pH計測定pH;采用生物傳感分析儀測定殘?zhí)呛俊?/p>

1.5.5 生物量測定 靜置培養(yǎng)后過濾菌絲體，蒸餾水洗滌3次。50℃烘干至恒重，天平稱重，每個條件取3個平行。

生物量=菌絲干重/0.035

1.5.6 胞內多糖的測定 烘干的菌絲研磨成粉，取1 g粉末加入1 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，充分震蕩，60℃水浴1 h，10000 r·min-1離心10 min，上清液即為多糖樣品。取0.5 mL稀釋400倍的多糖樣品，加入0.75 mL 5%苯酚溶液和3.75 mL濃硫酸，混勻，室溫靜置30 min，490 nm測吸光值。以葡萄糖為標準品，用同等方法繪制標準曲線，得到標準曲線y=7.21248x-0.00133，將樣品吸光值代入標曲，可以計算出多糖含量。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉的鑒定

2.1.1 紅曲霉的菌落特征 紅曲霉菌落初期為白色，7 d培養(yǎng)后，顏色逐漸變?yōu)槌壬?、紅色或黃色。菌落形狀主要呈絨毯狀和皮膜狀，大多有放射狀的溝紋。

2.1.2 紅曲霉的分子鑒定 由圖1的系統(tǒng)發(fā)育樹可知親緣相近程度，本試驗的紅曲霉Y1菌株與M.rutilus、M.aurantiacus和M.purpureus聚類在同一支，且與M.purpureus最接近，表明它是M.purpureus。

2.2 不同深層發(fā)酵時間對紅曲霉菌絲球的影響

考察了深層發(fā)酵時間對紫紅曲霉的胞內多糖合成的影響，結果發(fā)現(xiàn)（圖2），隨著振蕩培養(yǎng)時間的延長，菌絲球形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化。第1 d菌絲球直徑小，密度低，成球發(fā)育不充分;第2 d密度增加，菌絲球形狀不規(guī)則，成球松散，著色淺;第3 d菌絲球生長旺盛，菌絲長度和密度都增加，著色較深，顆粒飽滿緊實;第4 d菌絲球仍然比較致密，球形規(guī)則，但著色開始變淺;第5 d邊緣菌絲開始散亂，整體不夠圓潤，著色淺。結合菌球數(shù)的結果（圖3）可知，隨著深層發(fā)酵時間的延長，菌絲球個數(shù)大致呈現(xiàn)上升后降低的趨勢。深層發(fā)酵時間越長，菌絲球數(shù)量越密集，第3 d和第4 d相差不是很大。

2.3 不同深層發(fā)酵時間對紫紅曲霉發(fā)酵液黏度的影響

由圖4可知，隨著深層發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液黏度先降低后逐漸升高，第3 d黏度值較低。發(fā)酵過程中，菌絲的黏附和聚集會影響菌絲與氧的交換、營養(yǎng)物和代謝廢物的傳質效率，從而降低細胞生長速度和代謝產物的合成效率。

2.4 不同深層發(fā)酵時間對紅曲霉發(fā)酵液pH和殘?zhí)堑挠绊?/p>

由圖5可知，在深層發(fā)酵培養(yǎng)紅曲霉的5 d中，pH呈現(xiàn)從酸性到中性的轉變。原因可能是由于紅曲霉在發(fā)酵過程中產生的次生代謝產物所致。由圖6可知，在發(fā)酵過程中，葡萄糖含量逐漸下降，這表明紫紅曲霉在利用葡萄糖用于自身生長，5 d內葡萄糖從最初的35 g·L-1下降到16 g·L-1。

2.5 不同深層發(fā)酵時間對紅曲霉生物量的影響

由圖7可知，深層發(fā)酵第3 d整體的生物量更高。轉移到靜置培養(yǎng)后，紫紅曲菌絲體干重隨時間的增加而增加。前6 d生物量增長最快，隨后減緩，最高生長速度達1.14 g·L-1·d-1。

2.6 靜置培養(yǎng)時間對胞內多糖含量及產量的影響

由圖8、圖9可知，紅曲霉的內多糖含量和產量均呈先上升后下降的趨勢。從整體看，深層發(fā)酵第3 d，內多糖的含量和產量明顯高于其他。培養(yǎng)的前6 d，隨著靜置培養(yǎng)時間的增加，多糖的含量也隨之增加，深層發(fā)酵培養(yǎng)3 d接著靜置培養(yǎng)6 d時多糖含量最高，達18.9 mg·g-1，產量為138.9 mg·L-1;隨著靜置培養(yǎng)時間的延長，多糖的含量和產率逐漸降低。結果表明，靜置培養(yǎng)6 d是獲得紅曲霉多糖的最佳時間。

3 討論與結論

本試驗結果顯示，液體深層搖瓶發(fā)酵第3 d，菌絲生長旺盛，呈大小適中的球狀，此時發(fā)酵液黏度較低，傳質效果好，pH適中，有利于后續(xù)產物的積累。深層發(fā)酵3 d后轉移至靜置培養(yǎng)，6 d時胞內多糖產量最高。隨著時間延長，產量開始下降，原因可能是營養(yǎng)物質缺乏導致。液體深層發(fā)酵過程中，菌絲體形態(tài)和生理特性的變化會導致發(fā)酵液的黏度發(fā)生改變，從而影響營養(yǎng)物質和氧氣的溶解、傳遞和分布[16]，最終對發(fā)酵產物的積累產生較大作用[17]。絲狀真菌的生長條件可人為控制，菌絲形態(tài)隨著培養(yǎng)條件的不同而變化，一般呈絮狀、團狀和球狀3種[18]，探究最佳培養(yǎng)時間對紅曲霉內多糖的產量至關重要。

本研究先從紅曲米中分離出紅曲霉，經鑒定此菌株為紫紅曲霉，再采用液態(tài)搖瓶靜置兩階段法進行培養(yǎng)。通過測定紅曲霉發(fā)酵過程中的黏度、pH、殘?zhí)?，確定了紅曲霉產胞內多糖的最佳深層發(fā)酵時間和靜置培養(yǎng)時間。當深層發(fā)酵時間為3 d，靜置培養(yǎng)時間為6 d時，紅曲多糖的含量和產量均達到最高，分別為18.9 mg·g-1和138.9 mg·L-1。由此可知，用液態(tài)搖瓶靜置兩階段法生產紅曲胞內多糖是一種有成效的方法。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-10-10

作者簡介：余慧菁，女，1997年生，碩士，主要從事紅曲霉發(fā)酵方向研究。

通信作者：章文賢，男，1972年生，副教授，主要從事真菌次生代謝產物合成調控研究（E-mail：wxzhang@fjnu.edu.cn）。

基金項目：福建省自然科學基金項目（2017J01624）。