辣椒疫霉菌拮抗細(xì)菌L14-3的生防潛力及其鑒定

潘培培 劉東平 謝太震 張忠良 杜南山 樸鳳植 申順善

摘 要：為探討L14-3菌株對辣椒疫病的生防潛力，采用皿內(nèi)對峙試驗和孢子萌發(fā)試驗，測定其對辣椒疫霉菌的抑制活性，通過盆栽試驗驗證其對辣椒疫病的防治效果，并根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，L14-3菌株對辣椒疫霉菌的菌絲生長、游動孢子囊的形成、游動孢子的釋放和休止孢子的萌發(fā)均具有顯著的抑制作用;在盆栽試驗中，L14-3處理對辣椒疫病的防治效果達(dá)到75.00%。經(jīng)過鑒定，L14-3菌株為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

關(guān)鍵詞：辣椒;多黏類芽孢桿菌;疫病;抑制活性;防治效果;鑒定

中圖分類號：S641.3+S436 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）01-029-06

Biocontrol potential of antagonistic bacteria L14-3 against Phytophthora capsici and its identification

PAN Peipei1， LIU Dongping1， XIE Taizhen1， ZHANG Zhongliang1， DU Nanshan2， PIAO Fengzhi2， SHEN Shunshan1

（1. Henan New Pesticide Discovery Key Laboratory/College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to study the biocontrol potential of strain L14-3 against phytophthora blight of pepper， the antifungal activity of strain L14-3 against Phytophthora capsici were detected by in vitro and pot experiments. The results showed that， in vitro experiment， L14-3 was significant inhibit the mycelial growth， zoosporangium production， release and germination of zoospore of P. capsici. In the pot experiment， L14-3 performed the successful potential control against Phytophthora blight of pepper， the control efficiencies was 75.00%. In addition， based on the morphological，physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis， the strain L14-3 was identified as Paenibacillus polymyxa.

Key words： Pepper; Paenibacillus polymyxa; Phytophthora blight; Aantifungal activity; Control effect; Identification

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的一種具有毀滅性的土傳病害，在辣椒整個生育期均會發(fā)生。此病害發(fā)病速度快，傳播范圍廣，給辣椒生產(chǎn)造成非常嚴(yán)重的損失[1]。近年來，不合理的輪作制度、水肥過度使用及品種抗病性差等因素，造成土壤中病原菌逐年積累，進(jìn)而導(dǎo)致辣椒疫病的發(fā)生與流行。雖然目前已有多種防治方法，但是都存在著各種局限和不足。首先是現(xiàn)有的抗病品種單一，大多數(shù)抗病基因只能在一定的種、屬之間表達(dá)，而幾乎所有抗病品種都只對某一種或者少數(shù)幾種致病微生物有抵抗能力;其次是土壤消毒的方法雖然簡單、有效，但大多數(shù)只能局限于設(shè)施農(nóng)業(yè)，在大田農(nóng)業(yè)中很難實現(xiàn)，并且用化學(xué)藥劑還會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，并對環(huán)境造成污染[2]。植物根際細(xì)菌是指生長在植物根圈兒范圍內(nèi)所有細(xì)菌的統(tǒng)稱，其中很多細(xì)菌能促進(jìn)植物生長，防治植物病害，改善植物微生態(tài)環(huán)境，被稱為植物根際促生細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）。植物根際促生細(xì)菌因其促生、防病、改善土壤微生態(tài)及對環(huán)境友好等特點，彌補了植物病害傳統(tǒng)防治方法的缺陷與不足，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分廣闊的應(yīng)用前景[3]。目前，利用植物根際促生細(xì)菌防治辣椒疫病的研究比較活躍。如從小麥根際分離的菌株綠針假單胞菌HG28-5，不僅對辣椒疫病具有顯著的防治作用，還能夠促進(jìn)辣椒生長[4];枯草芽孢桿菌IBFCBF-4對辣椒疫病的防效高達(dá)64.28%，并可顯著促進(jìn)辣椒生長[5];解淀粉芽孢桿菌CRJ-9對辣椒疫霉菌的拮抗作用明顯，對辣椒疫病的防治效果顯著[6]。

筆者從油菜根際分離的根際微生物中篩選出具有拮抗活性的L14-3菌株，確認(rèn)其對辣椒疫霉菌的抑制活性和辣椒疫病的防治效果，在此基礎(chǔ)上，對L14-3菌株進(jìn)行了形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析等方面的鑒定，研究其生防潛力，為辣椒疫病的生物防治提供了一定的理論依據(jù)和生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)苯菲贩N為‘新金富808（河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司）。供試菌株：L14-3菌株分離自河南省許昌采集的健康油菜根際土壤，保存于實驗室-80 ℃超低溫冰箱;辣椒疫霉菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治研究室分離保存并鑒定。

供試培養(yǎng)基：供試培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基（土豆200 g，切成小塊煮沸15 min，雙層紗布過濾，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL）、PDK培養(yǎng)基（土豆200 g，切成小塊煮沸15 min，雙層紗布過濾，蛋白胨10 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 000 mL）、TSA培養(yǎng)基（TSB 30 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 000 mL）和V8A培養(yǎng)基（V8 Juice 100 mL，碳酸鈣1 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2018年7月至2019年8月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室進(jìn)行。在室內(nèi)進(jìn)行L14-3菌株對辣椒疫霉菌抑制活性的測定，包括菌絲生長、游動孢子囊形成、游動孢子釋放及孢子萌發(fā)等;然后通過盆栽試驗測定L14-3菌株對辣椒疫病的防治效果，試驗設(shè)3個處理（L14-3處理、清水處理及健康對照），隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù);另外，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析等對L14-3菌株進(jìn)行鑒定。

1.3 L14-3菌懸液的配制

將L14-3菌株在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，用濃度為0.1 mol·L-1無菌MgSO4溶液刮菌制成108 cfu·mL-1的菌懸液待用。

1.4 辣椒疫霉菌孢子懸浮液的配制

將辣椒疫霉菌在V8A培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，在超凈工作臺上用打孔器在菌落邊緣打菌餅，將其放在空的無菌培養(yǎng)皿中并加入無菌水，加到菌落剛好浸濕，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。待形成游動孢子囊后，置于4 ℃冰箱30 min，誘發(fā)其釋放游動孢子，收集游動孢子并稀釋為104 cfu·mL-1的游動孢子懸浮液。

1.5 L14-3對辣椒疫霉菌的抑制活性測定

1.5.1 菌絲生長的抑制活性測定 菌株L14-3對辣椒疫霉菌菌絲的抑制能力測定采用平板對峙培養(yǎng)法。將辣椒疫霉病菌接種在PDA平板上培養(yǎng)，2 d后用打孔器取直徑5 mm辣椒疫霉菌菌餅，接在PDK平板中央，距離菌餅25 mm處接種L14-3，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后觀察抑菌圈大小。

1.5.2 游動孢子囊形成的抑制活性測定 將辣椒疫霉菌在V8A培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，然后用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，把菌餅放在滅菌后的培養(yǎng)皿中，然后加入L14-3菌懸液（108 cfu·mL-1），使菌懸液剛剛浸沒菌餅表面，置于25 ℃光照恒溫箱中培養(yǎng)16 h之后，在10×10倍的顯微鏡下觀察，并記錄每個視野中產(chǎn)生游動孢子囊的數(shù)量。以加入無菌水作為對照。

1.5.3 游動孢子釋放的抑制活性測定 將產(chǎn)生孢子囊的疫霉菌菌餅放入滅菌后的培養(yǎng)皿中，加入L14-3菌懸液（108 cfu·mL-1）至浸沒菌餅，然后在4 ℃冰箱中放置0.5 h，誘發(fā)其釋放游動孢子，在10×10倍顯微鏡下觀察，并記錄游動孢子囊總數(shù)和孢子囊空殼數(shù)，計算游動孢子釋放率。以加入無菌水作為對照。

釋放率/%=游動孢子囊空殼數(shù)/游動孢子囊總數(shù)×100。

1.5.4 休止孢子萌發(fā)的抑制活性測定 辣椒疫霉菌的游動孢子囊釋放游動孢子后，用雙層紗布過濾，獲得休止孢子懸浮液。取等量的休止孢子懸浮液和L14-3菌懸液，均勻混合之后滴加到凹玻片上，然后將其放到28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每2 h在顯微鏡下調(diào)查孢子萌發(fā)數(shù)，計算休止孢子萌發(fā)率。以混合無菌水作為對照。

萌發(fā)率/%=萌發(fā)孢子數(shù)/休止孢子總數(shù)×100。

1.6 L14-3對辣椒疫病的防治效果測定

將辣椒苗培育至4～5片真葉，選取健壯辣椒苗移栽于直徑為90 mm的花盆中，灌注L14-3菌懸液（108 cfu·mL-1，50 mL·株-1），然后沿花盆壁接種辣椒疫霉游動孢子懸浮液（104 cfu·mL-1， 5 mL·株-1），試驗設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)5株，以清水作為對照。置于溫室培養(yǎng)，參考病情分級標(biāo)準(zhǔn)，計算病情指數(shù)及防治效果[7]。

病情指數(shù)=[∑（各級發(fā)病數(shù)×各級代表數(shù)）調(diào)查總數(shù)×最高級代表值]×100;

防治效果/%=[對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對照病情指數(shù)]×100。

1.7 L14-3對多種病原菌的抑菌效果測定

采用平板對峙法測定L14-3的抑制活性。將供試病原菌菌餅放在PDK平板中央，在距離菌餅25 mm處接種L14-3，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，然后觀察并記錄抑菌圈大小。

1.8 L14-3的鑒定

1.8.1 形態(tài)和培養(yǎng)特性的觀察 將L14-3菌株在TSA平板上劃線培養(yǎng)，3 d后觀察菌落的形狀、大小、顏色、光澤、黏稠度、透明度、邊緣特征等。L14-3菌體形態(tài)特征的觀察采用革蘭氏染色法，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[8]。

1.8.2 生理生化特性的測定 生理生化特性主要參照《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》進(jìn)行測定[9]。

1.8.3 16S rDNA序列同源性分析 在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)L14-3，挑取細(xì)菌單菌落。使用生工生物科技有限公司的試劑盒提取細(xì)菌DNA。引物采用的是細(xì)菌通用引物，分別為27 f （AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG）和1 492 r（TAC GGH TAC CTT ACG ACTT），PCR擴增采用50 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%（m/V）的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。擴增產(chǎn)物送生物公司測序，測序結(jié)果利用NCBI Blast檢索比對，并采用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 6.5和Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以最小顯著差數(shù)法（LSD）分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 L14-3對辣椒疫霉菌的抑制活性

菌絲生長的抑制效果：L14-3菌株對辣椒疫霉菌菌絲生長具有較強的抑制活性。在PDK培養(yǎng)基平板上抑制辣椒疫霉菌菌絲生長，能夠形成明顯的抑菌帶（圖1），抑菌帶寬度為0.74 cm。游動孢子囊形成的抑制效果：在10×10倍顯微鏡下，對照的視野中能夠形成189.33個游動孢子囊，而L14-3菌株處理的視野中只形成了6.33個，對辣椒疫霉菌游動孢子囊形成的抑制率達(dá)96.66%（表1）。游動孢子釋放的抑制效果：在10×10倍鏡下，對照的視野中，游動孢子的釋放率為70.69%，而L14-3菌株處理的視野中，游動孢子釋放率為0.86%，其抑制率達(dá)98.78%（表2）。休止孢子萌發(fā)的抑制效果：在水中培養(yǎng)2 h時休止孢子萌發(fā)率為38.44%，培養(yǎng)8 h時萌發(fā)率達(dá)到98.50%，而L14-3菌株處理的休止孢子培養(yǎng)2 h時沒有萌發(fā)，培養(yǎng)8 h時萌發(fā)率僅達(dá)到4.20%，對孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到99.57%（圖2）。

2.2 L14-3對辣椒疫病的防治效果

在盆栽試驗中，L14-3菌株對辣椒疫病具有顯著的防治效果。對照辣椒苗在處理第7天時莖基部開始皺縮變褐，第12天時病情指數(shù)為64.00;而L14-3菌株處理的辣椒苗，第10天開始表現(xiàn)出輕微癥狀，第12天時的病情指數(shù)為16.00，對辣椒疫病的防治效果達(dá)到75.00%（表3，圖3）。

2.3 L14-3對多種病原菌的抑制效果

L14-3菌株除辣椒疫霉菌以外，對多種植物病原菌具有抑菌活性，其抑菌帶寬度大于0.75 cm，顯示其生防潛力（表4，圖4）。

2.4 L14-3的鑒定

L14-3菌體為直桿狀，革蘭氏陽性，在TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為米黃色、半透明、邊緣不整齊的不規(guī)則形。在4～50 ℃范圍內(nèi)均能生長，耐鹽度不高于4%，可以利用葡萄糖和蔗糖，不能利用果糖，硝酸鹽還原反應(yīng)、淀粉水解反應(yīng)呈陽性，亞硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化呈陰性（表5）。另外，以L14-3菌株總DNA為模板，PCR擴增出長度約為1.5 kb的DNA片段?；厥赵撈芜M(jìn)行序列測定結(jié)果，L14-3的16S rDNA片段序列長為1 579 bp，進(jìn)行NCBI BLAST比對的結(jié)果表明，與多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）的16S rDNA序列相似性達(dá)到99%，并對其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。因此，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析，將L14-3菌株鑒定為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

3 討論與結(jié)論

辣椒疫霉菌主要以卵孢子在土壤中和病殘體上越冬，在適宜的溫度和濕度條件下，辣椒疫霉菌產(chǎn)生新的孢子囊，釋放游動孢子，孢子萌發(fā)侵入辣椒的根部、莖基部和葉部。在辣椒的整個生長發(fā)育期間，發(fā)病的辣椒植株上的疫霉菌會不斷產(chǎn)生孢子囊和游動孢子，發(fā)生多次再侵染。一般辣椒疫霉菌的菌絲、孢子囊或孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管初次侵染植株后，營養(yǎng)菌絲在寄主細(xì)胞間生長，通過無性繁殖形成孢子囊。在潮濕環(huán)境下，孢子囊萌發(fā)再次侵染植株，往復(fù)循環(huán)。田間辣椒疫霉菌的侵入和傳播主要靠游動孢子囊和游動孢子，可造成病原菌的大量傳播及病害的流行[10]。馬艷等[11]篩選的拮抗真菌F-310能抑制病原菌孢子囊的形成，又能抑制已經(jīng)形成的孢子囊和游動孢子的萌發(fā)，從而抑制了病菌的無性繁殖。本研究結(jié)果表明，L14-3菌株不僅能抑制辣椒疫霉菌菌絲生長，還能抑制游動孢子囊的形成、游動孢子釋放及休止孢子的萌發(fā)，抑制辣椒疫霉菌侵入，阻斷辣椒疫霉菌再次形成侵染源及再次侵染，切斷病害擴散蔓延，可有效控制病害的發(fā)生和流行，為辣椒疫病的生物防治提供了一定的理論依據(jù)和生防資源。

芽孢桿菌因繁殖速度快、對高溫和干旱的耐性強、對營養(yǎng)要求比較簡單和定殖能力強等優(yōu)點成為植物病害生物防治中研究應(yīng)用最多的一類生防微生物[12-13]。已報道，枯草芽孢桿菌和蠟質(zhì)芽孢桿菌對水稻紋枯病有較好的防治效果[14];特基拉芽孢桿菌XT1-4對馬鈴薯黃萎病菌的拮抗作用比較明顯，防治效果達(dá)到60%以上[15];多黏類芽孢桿菌BRF-1的代謝產(chǎn)物能夠抑制枯萎病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，盆栽防治效果顯著，并且能夠促進(jìn)植株的生長[16]。本研究中篩選的L14-3菌株為多黏類芽孢桿菌，對辣椒疫霉菌有較強的抑制活性，其抑菌譜比較廣，除辣椒疫霉菌以外，對鐮孢菌等多種植物病原菌物具有顯著抑菌活性。與姜旭[17]研究中結(jié)果一致，多黏類芽孢桿菌BRF-1能夠抑制枯萎病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，盆栽防治效果顯著，并且能夠促進(jìn)植株生長。同時，菌株L14-3在室內(nèi)培養(yǎng)條件下具有產(chǎn)生嗜鐵素、分解纖維素和分解蛋白等特性（結(jié)果未列出），是一株多功能的具有較大生防潛力的生防菌。生防微生物防治植物病害的機制是多方面的，包括分泌拮抗活性物質(zhì)、與病原物競爭營養(yǎng)和生態(tài)位、誘導(dǎo)植物抗性等，有關(guān)L14-3菌株在田間的使用效果及具體防病機制還有待進(jìn)一步探索和研究。

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