基于NaCl重吸收抑制作用的石韋利尿活性成分篩選

隋 怡，滕明剛，羅國(guó)勇，柴慧芳，龍 毅，楊武德

基于NaCl重吸收抑制作用的石韋利尿活性成分篩選

隋 怡，滕明剛，羅國(guó)勇，柴慧芳，龍 毅，楊武德*

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025

建立基于抑制NaCl重吸收作用的利尿藥物體外篩選模型，研究21個(gè)從石韋中分離的化合物的利尿活性，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。采用犬腎小管上皮細(xì)胞MDCK對(duì)石韋中21個(gè)化合物進(jìn)行體外利尿活性篩選，確定NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的最佳NaCl劑量；將MDCK細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，設(shè)置對(duì)照組、石韋化合物（100 μmol/L）組、氫氯噻嗪（100 μmol/L）組，給藥孵育24 h后，加入NaCl溶液（15 mg/mL），于30 min、2 h、4 h分別取Transwell下室培養(yǎng)液，檢測(cè)Cl?和Na＋吸光度。昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、綠原酸甲酯（10 mg/kg）組、山柰酚（10 mg/kg）組、氫氯噻嗪（10 mg/kg）組，給予藥物干預(yù)5 d后，檢測(cè)各組小鼠5 h內(nèi)的尿量。與對(duì)照組比較，加入NaCl 30 min，氫氯噻嗪組MDCK細(xì)胞Cl?和Na＋水平顯著降低（＜0.05），綠原酸甲酯組MDCK細(xì)胞Na＋水平顯著降低（＜0.05）；加入NaCl 2 h，綠原酸甲酯組MDCK細(xì)胞Cl?水平顯著降低（＜0.05）。與對(duì)照組比較，綠原酸甲酯組和氫氯噻嗪組小鼠給藥后5 h內(nèi)的總尿量顯著增加（＜0.05）；氫氯噻嗪組和綠原酸甲酯組小鼠尿量峰值分別為給藥后1.5、2.5 h，隨后尿量均呈下降趨勢(shì)。綠原酸甲酯可抑制腎小管氯化鈉轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)小鼠具有利尿作用，是石韋中的利尿活性成分。

活性篩選；利尿；石韋；綠原酸甲酯；重吸收

利尿藥是一類能夠促進(jìn)機(jī)體水分排出從而使尿量增加的藥物，臨床上常用于治療水腫、高血壓等[1]。石韋為水龍骨科植物廬山石韋(Bak.) Ching、石韋(Thunb.) Farwell或有柄石韋(Christ) Ching的干燥葉，具有利尿通淋、清肺止咳、涼血止血的功效，主治熱淋、血淋、石淋等癥[2]。課題組前期從石韋中提取并分離出里白烯、β-谷甾醇、綠原酸、芒果苷、異芒果苷、槲皮素、異槲皮素、蔗糖等21個(gè)化合物[3]，但其利尿通淋的活性成分尚不明確。傳統(tǒng)的利尿藥物篩選方法多為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)且不適用于批量化合物的篩選。本研究采用Transwell小室模擬腎小管，建立Transwell小室內(nèi)外NaCl濃度差，探究具有抑制NaCl轉(zhuǎn)運(yùn)作用的化合物，從而篩選出具有抑制腎小管細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)NaCl作用的化合物；并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證化合物的利尿作用，為石韋利尿通淋的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

犬腎小管上皮細(xì)胞MDCK購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自重慶騰鑫有限公司，合格證號(hào)SCXK（遼）2015-0001。于溫度22～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%下，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循貴州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.3 藥材

黔產(chǎn)有柄石韋（批號(hào)20160625）由龍里縣灣灘河鎮(zhèn)彎寨石頭村李紅提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室周漢華教授鑒定為水龍骨科植物有柄石韋(Christ) Ching的干燥葉。

1.4 藥品與試劑

氫氯噻嗪片劑（批號(hào)20180324，規(guī)格25 mg/片）購(gòu)自常州制藥廠有限公司；NaCl（批號(hào)20150928）購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；Cl?、Na＋檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為20190628、20190625）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；胎牛血清（貨號(hào)11011-8611）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)C11995500BT）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（貨號(hào)02-024-1ACS）、青霉素-鏈霉素溶液（貨號(hào)03-031-1B）、胰酶（貨號(hào)03-050-1B），均購(gòu)自以色列BI公司。

1.5 儀器

雙人超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋電器股份有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本尼康）；自動(dòng)酶標(biāo)讀儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；Millicell-ERS-2型細(xì)胞電阻儀（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 石韋中化合物的分離

課題組前期從黔產(chǎn)有柄石韋中提取并分離的21個(gè)化合物見表1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于96%[2]。

表1 從有柄石韋中分離的化合物信息

2.2 MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)

MDCK細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 藥物的配制

NaCl溶于DMEM培養(yǎng)基，分別配制成質(zhì)量濃度為12、15、18、21、24、27、30、33、36 mg/mL的溶液。表1中的化合物分別溶于DMEM培養(yǎng)基，配制成100 μmol/L的溶液。

2.4 NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)劑量的篩選

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞，接種于96孔板。設(shè)置對(duì)照組和9個(gè)質(zhì)量濃度（12、15、18、21、24、27、30、33、36 mg/mL）NaCl組，各組分別加入相應(yīng)溶液，對(duì)照組加入生理鹽水，培養(yǎng)8 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，確定NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的最佳NaCl質(zhì)量濃度。

2.5 石韋中分離的化合物對(duì)NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞，以4×105/mL接種于Transwell小室內(nèi)，下室加入1 mL培養(yǎng)基以適應(yīng)細(xì)胞正常生長(zhǎng)。細(xì)胞貼壁后，于37 ℃測(cè)定各孔細(xì)胞的電阻值[4]。取跨膜電阻值≥300 Ω·cm2的MDCK細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組、石韋中分離的不同化合物（100 μmol/L）組、氫氯噻嗪（100 μmol/L）組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去Transwell小室內(nèi)液體，加入NaCl（15 mg/mL）溶液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于30 min、2 h和4 h吸取50 μL下室中的液體，按照試劑盒說明書檢測(cè)Cl?、Na＋的吸光度。

2.6 石韋中分離的化合物對(duì)小鼠的利尿作用

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、綠原酸甲酯（10 mg/kg）組、山柰酚（10 mg/kg）組、氫氯噻嗪（10 mg/kg）組，每組7只。各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物（20 μL/g），對(duì)照組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)5 d。給藥結(jié)束后，各組小鼠ip 1 mL生理鹽水，立即放入提前墊好3層濾紙的代謝籠中，每30分鐘稱定濾紙質(zhì)量并更換，連續(xù)記錄5 h內(nèi)濾紙質(zhì)量，并計(jì)算5 h內(nèi)小鼠尿量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)劑量的篩選

如圖1所示，NaCl抑制MDCK細(xì)胞活力，呈劑量相關(guān)性。NaCl的質(zhì)量濃度高于15 mg/mL，MDCK細(xì)胞存活率均低于50%。因此，選擇15 mg/mL NaCl進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，孵育時(shí)間為4 h以內(nèi)，該條件下既能使MDCK細(xì)胞兩側(cè)維持一定的NaCl質(zhì)量濃度梯度，又不影響細(xì)胞活力。

3.2 石韋分離的化合物對(duì)Cl?和Na＋體外轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，加入NaCl 30 min，壩巴酸、(23)-cycloart-23-ene-3β,25-diol和氫氯噻嗪組MDCK細(xì)胞Cl?水平顯著降低（＜0.05），Cl?跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制；加入NaCl 2 h，綠原酸甲酯組MDCK細(xì)胞Cl?水平顯著降低（＜0.05），Cl?跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制。

圖1 不同質(zhì)量濃度的NaCl對(duì)MDCK細(xì)胞活力的影響()

與對(duì)照組比較，加入NaCl 30 min，綠原酸甲酯、氫氯噻嗪組MDCK細(xì)胞Na+水平顯著降低（＜0.05），Na＋跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制；加入NaCl 4 h，各組MDCK細(xì)胞Na＋水平均無明顯差異。

3.3 石韋中分離的綠原酸甲酯和山柰酚對(duì)小鼠的利尿作用

如表3所示，與對(duì)照組比較，給藥后第3小時(shí)內(nèi)，綠原酸甲酯和氫氯噻嗪組小鼠尿量顯著增加（＜0.05），2組無顯著性差異；綠原酸甲酯和氫氯噻嗪組小鼠給藥后5 h內(nèi)的總尿量顯著增加（＜0.05）。如圖2所示，氫氯噻嗪組小鼠尿量在給藥后1.5 h達(dá)到峰值，隨后尿量呈下降趨勢(shì)；綠原酸甲酯組小鼠尿量在給藥后2.5 h達(dá)到峰值，隨后尿量呈下降趨勢(shì)；山柰酚組小鼠尿量在給藥后2 h達(dá)到峰值。

4 討論

尿液的生成和排出包括腎小球?yàn)V過和腎小管重吸收2個(gè)過程。重吸收是指腎小管上皮細(xì)胞將小管液原尿中的水分和某些溶質(zhì)，部分或全部轉(zhuǎn)運(yùn)至血液。腎小球?yàn)V過的原尿中99%的水被重吸收[5-7]。目前大多數(shù)利尿藥物如碳酸酐酶抑制劑、Na＋-Cl?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑、Na＋-K＋-2Cl?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑、阻斷腎小管上皮Na＋通道藥物、鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑等均通過影響原尿重吸收從而發(fā)揮利尿作用[8-10]，其中以噻嗪類藥物為代表的Na＋-Cl?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑和以呋塞米為代表的Na＋-K＋-2Cl?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑臨床應(yīng)用廣泛[11-12]。因此，抑制腎小管NaCl的轉(zhuǎn)運(yùn)為影響利尿藥物活性的重要機(jī)制。本研究采用接種MDCK細(xì)胞的Transwell小室模擬腎小管，篩選具有抑制腎小管NaCl轉(zhuǎn)運(yùn)作用的化合物。

NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，加入NaCl 30 min，氫氯噻嗪組和綠原酸甲酯組MDCK細(xì)胞Cl?和Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)被明顯抑制，壩巴酸組和(23)-cycloart-23-ene-3β,25-diol組MDCK細(xì)胞Cl?轉(zhuǎn)運(yùn)被明顯抑制；加入NaCl 2 h，綠原酸甲酯組MDCK細(xì)胞Cl?轉(zhuǎn)運(yùn)被明顯抑制。表明壩巴酸、(23)-cycloart-23-ene-3β,25-diol和綠原酸甲酯是石韋中具有抑制Na＋和Cl?轉(zhuǎn)運(yùn)活性的化合物。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)從石韋中分離的化合物對(duì)Cl?和Na＋體外轉(zhuǎn)運(yùn)的影響()

與同時(shí)間對(duì)照組比較：*＜0.05，下表同

*< 0.05control group at the same time, same as blow table

表3 石韋中分離的綠原酸甲酯和山柰酚對(duì)小鼠的利尿作用(，n = 7)

圖2 石韋中分離的綠原酸甲酯和山柰酚對(duì)小鼠的利尿作用(，n = 7)

課題組前期對(duì)21個(gè)石韋化合物與Na＋-Cl?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體激活的上游大分子[13-15]進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)山柰酚和綠原酸甲酯與賴氨酸蛋白缺乏激酶1（with no lysinekinase1，WNK1）具有良好的結(jié)合活性。因此，結(jié)合NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察山柰酚和綠原酸甲酯對(duì)小鼠的利尿作用，結(jié)果顯示，綠原酸甲酯對(duì)小鼠具有顯著的利尿作用，起效峰值在給藥后3 h，且其5 h內(nèi)的利尿作用與氫氯噻嗪無明顯差異；山柰酚對(duì)小鼠具有一定的利尿作用，但其尿量與對(duì)照組比較無明顯差異，其尿量峰值在給藥后2 h，與NaCl體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上，綠原酸甲酯具有良好的體內(nèi)和體外利尿活性，與氫氯噻嗪療效相當(dāng)，是石韋的利尿活性成分，其利尿機(jī)制與抑制腎小管上皮細(xì)胞NaCl的重吸收作用有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening of active components frombased on inhibition of NaCl reabsorption

SUI Yi, TENG Ming-gang, LUO Guo-yong, CHAI Hui-fang, LONG Yi, YANG Wu-de

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China

To establish anscreening model of diuretic drugs based on the inhibition of NaCl reabsorption, study and verify the diuretic activity of 21 compounds isolated from.Canine renal tubular epithelial MDCK cell was used to screen for diuretic activity of 21 compounds isolated fromto determine the optimal NaCl dose for the transport experiment of NaCl; MDCK cells were inoculated into Transwell chamber, and control group; Compound from(100 μmol/L) group and hydrochlorothiazide (100 μmol/L) group were set up, after 24 h of incubation, NaCl solution (15 mg/mL) was added, the Transwell lower chamber culture medium was respectively taken at 30 min, 2 h, and 4 h, and the Cl?and Na＋absorbance were measured. KM mice were randomly divided into control group, methyl chlorogenate (10 mg/kg) group, kaempferol (10 mg/kg) group, and hydrochlorothiazide (10 mg/kg) group. After drug intervention for 5 d, urine volume of mice in each group was tested within 5 h.Compared with control group, after adding NaCl for 30 min, the levels of Cl?and Na＋in MDCK cells of hydrochlorothiazide group were significantly reduced (< 0.05), and the levels of Na＋in MDCK cells in methyl chlorogenate group were significantly reduced (< 0.05); After adding NaCl for 2 h, the level of Cl?in MDCK cells in methyl chlorogenate group was significantly reduced (< 0.05). Compared with control group, the total urine output of mice in methyl chlorogenate group and hydrochlorothiazide group were significantly increased within 5 h after administration (< 0.05); The peak urine output of the mice in hydrochlorothiazide group and methyl chlorogenate group were respectively 1.5 h and 2.5 h after administration, the urine output showed a downward trend.Methyl chlorogenate, the diuretic active ingredient in, could inhibit the transport of sodium chloride in the renal tubules and has a diuretic effect on mice.

activity screening; diuretic;(Christ) Ching; methyl chlorogenate; reabsorption

R285.5

A

0253 - 2670(2021)04 - 1026 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.015

2020-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81660647）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910662004）

隋 怡（1990—），女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，從事中藥藥理和中藥毒理學(xué)研究。E-mail: 836017075@qq.com

楊武德（1968—），男，教授。E-mail: 2994771096@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]