基于多指標(biāo)響應(yīng)曲面法優(yōu)選醋炙香附炮制工藝及炮制終點(diǎn)量化研究

位玉蝶，李 沁，宋晨鴿，陳天朝, ，馬彥江

基于多指標(biāo)響應(yīng)曲面法優(yōu)選醋炙香附炮制工藝及炮制終點(diǎn)量化研究

位玉蝶1，李 沁1，宋晨鴿1，陳天朝1, 2*，馬彥江2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450008 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000

將飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的主觀經(jīng)驗(yàn)與其化學(xué)成分含量的客觀指標(biāo)相結(jié)合，多指標(biāo)、綜合評(píng)價(jià)醋炙香附的最佳炮制工藝，并對(duì)炮制終點(diǎn)的判斷進(jìn)行量化。基于Box-Behnken設(shè)計(jì)醋炙香附炮制工藝，通過(guò)德爾菲評(píng)價(jià)對(duì)醋香附不同炮制品的外觀性狀進(jìn)行打分，以德爾菲評(píng)價(jià)的總得分為主觀評(píng)價(jià)指標(biāo)，以粗纖維、α-香附酮、圓柚酮、總黃酮、5-羥甲基糠醛（5-HMF）、總揮發(fā)油的含量為客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用CRITIC權(quán)重賦值法將主客觀指標(biāo)相結(jié)合，響應(yīng)面法優(yōu)選醋炙香附最佳炮制工藝。通過(guò)測(cè)定飲片的物性參數(shù)與色度，建立物性參數(shù)、色度與化學(xué)成分含量之間的相關(guān)性，找到與其內(nèi)在化學(xué)成分含量相關(guān)性最多的指標(biāo)，并用其量化炮制終點(diǎn)。醋炙香附的最佳炮制工藝：加米醋25%，使用帶刻度的噴壺均勻噴灑在藥材表面，每次噴灑5 mL，噴灑12次，悶潤(rùn)8 h至藥材內(nèi)無(wú)白心，140 ℃炮制7 min。pH值、氧化值均與色度*、*、Δ*（*為亮度，*為黃藍(lán)色度值，Δ*為總色值）值具有顯著負(fù)相關(guān)，吸水率與*、*、Δ*值具有顯著正相關(guān)；粗纖維含量與pH值、氧化值呈顯著負(fù)相關(guān)，與相對(duì)密度呈顯著正相關(guān)；α-香附酮含量與pH值、氧化值呈極顯著正相關(guān)，與*、*、Δ*值呈顯著負(fù)相關(guān)；圓柚酮含量與pH值、氧化值呈極顯著負(fù)相關(guān)，與*值呈顯著正相關(guān)；總揮發(fā)油含量與pH值、氧化值呈顯著正相關(guān)，與*、*、Δ*值呈顯著負(fù)相關(guān)。優(yōu)選的醋香附炮制工藝合理可行；推測(cè)香附在醋炙時(shí)將其pH值、氧化值分別控制在4.462～4.678、21.076 8～22.429 2，醋香附飲片整體狀態(tài)即可達(dá)到最佳。

醋香附；炮制工藝；響應(yīng)曲面法；物性參數(shù)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；質(zhì)量評(píng)價(jià)；量化；德爾菲評(píng)價(jià)；粗纖維；α-香附酮；圓柚酮；黃酮；5-羥甲基糠醛；揮發(fā)油；CRITIC權(quán)重賦值法；色度

香附為莎草科植物莎草L.的干燥根莖，始載于《名醫(yī)別錄》，經(jīng)醋制以后，可增強(qiáng)其疏肝解郁、活血散瘀之功效，是中藥醋制增效理論的代表中藥之一[1-2]。醋香附的炮制方法有醋煮法、醋蒸法、醋煮蒸法、醋炙法等[3]，但目前臨床應(yīng)用最多、且被《中國(guó)藥典》2015年版收載的僅有醋炙香附。香附醋炙后可理氣、消積，《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)醋炙香附炮制工藝的描述較為模糊，未明確規(guī)定炮制時(shí)間、炮制溫度，使得醋香附飲片質(zhì)量不均一、穩(wěn)定性差，并且對(duì)炮制終點(diǎn)的描述也僅為“表面黑褐色，微有醋香氣”，主觀性較強(qiáng)，隨意性較大，無(wú)法科學(xué)準(zhǔn)確的判斷炮制終點(diǎn)，而炮制終點(diǎn)的量化是炮制工藝標(biāo)準(zhǔn)化的前提，因此，將香附的炮制終點(diǎn)進(jìn)行量化，對(duì)保證醋香附飲片質(zhì)量的穩(wěn)定統(tǒng)一具有極大的促進(jìn)意義。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，一般是由有效成分、輔助成分、無(wú)效成分、組織成分等構(gòu)成，靠一種或幾種化學(xué)成分難以發(fā)揮中藥藥效，有時(shí)有效成分需與輔助成分及無(wú)效成分相結(jié)合才能發(fā)揮藥效或降低毒副作用，故在香附質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，不能選擇單一成分作為檢測(cè)指標(biāo)。香附主要成分為揮發(fā)油類，具有鎮(zhèn)靜、保護(hù)胃黏膜、調(diào)血脂、降血糖、抗炎、抗抑郁等藥理活性[4-6]，其中，α-香附酮、圓柚酮為香附揮發(fā)油中所含的特征性成分，是香附調(diào)經(jīng)止痛、疏肝理氣的主要有效成分；非揮發(fā)性成分如香附總黃酮具有較好的抗氧化、降血脂及調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，為香附有效成分之一[7]；纖維為香附的組織成分，能夠調(diào)節(jié)藥物溶出；研究表明[8-11]，飲片在炮制過(guò)程中，色澤、氣味的變化與5-羥甲基糠醛（5-HMF）的含量具有顯著相關(guān)性，5-HMF能防治神經(jīng)退行性疾病、減輕認(rèn)知損害和抗心肌缺血，具有一定的藥理活性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法，將粗纖維、總黃酮、α-香附酮、圓柚酮、5-HMF、總揮發(fā)油含量的客觀指標(biāo)與老藥工人為評(píng)價(jià)的主觀經(jīng)驗(yàn)通過(guò)CRITIC權(quán)重賦值法相結(jié)合，多指標(biāo)、綜合評(píng)價(jià)醋炙香附的最佳工藝，并通過(guò)建立飲片物性參數(shù)、色度與化學(xué)成分含量之間的相關(guān)性，確定可用于炮制終點(diǎn)量化的參數(shù)，為醋炙香附炮制工藝的標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)字化奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

UliMate3000高效液相色譜儀、Thermo Evolution 201紫外可見光分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛有限公司；CY-25炒藥機(jī)，功率7 kW，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；BSA224S-CW電子天平、CP225D電子天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)。

香附，批號(hào)190215，安徽人民中藥飲片有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定，符合莎草科莎草屬植物莎草L.的干燥根莖。米醋，批號(hào)A3.021081，廣東廚邦食品有限公司；對(duì)照品蘆丁，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥ 98%，批號(hào)100080-201811，中國(guó)食品藥品檢定研究院。對(duì)照品α-香附酮、圓柚酮、5-HMF，批號(hào)分別為Z08A10L94945、A10J10R79508、H12M9Z61023，上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 德爾菲評(píng)價(jià)

2.1.1 德爾菲評(píng)價(jià)專家的遴選 國(guó)家級(jí)老藥工：朱清山-河南省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)傳承人；河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部：陳天朝主任藥師、施鈞瀚主管藥師；河南中一經(jīng)營(yíng)有限公司：王宏賢副主任藥師、沈啟良副主任藥師。所選專家均具有豐富的中藥材鑒別、檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。

2.1.2 擬定咨詢問(wèn)卷 在參考《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)生品飲片規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)制定的基礎(chǔ)上，參照各地地方性炮制規(guī)范，篩選出表面特征、斷面特征、質(zhì)地、氣、味共5項(xiàng)指標(biāo)作為判定飲片等級(jí)的依據(jù)[1,12]，擬定的咨詢表作為專家評(píng)分的參考，咨詢表的制定具體如表1所示。

2.1.3 藥物飲片的評(píng)定 將飲片的生品與炮制品擺放于光照強(qiáng)度為250 lx的同一區(qū)域內(nèi)，邀請(qǐng)專家組成員進(jìn)行“盲法”評(píng)價(jià)和集中會(huì)評(píng)。將炮制專家評(píng)定的飲片的形、色、氣、味、質(zhì)的數(shù)值進(jìn)行整合，得出每種飲片的最終評(píng)分，結(jié)果見表2。

2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)均勻?qū)嶒?yàn)

基于《中國(guó)藥典》2015年版四部炮制通則及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定液體輔料用量（A）10%～30%，炒制溫度（B）110～150 ℃，炒制時(shí)間（C）5～30 min，具體見表2。精密稱量200.0 g香附飲片，按照藥輔比10%、20%、30%稱取米醋質(zhì)量應(yīng)分別為20.00、40.00、60.00 g，稱量后的米醋加水配制成相等質(zhì)量60 g，搖晃均勻。將配置好的醋液使用帶刻度的噴壺均勻噴灑在藥材表面，每次噴灑5 mL，噴灑12次，悶潤(rùn)8 h至藥材內(nèi)無(wú)白心。將悶潤(rùn)透心的飲片按照表2的工藝參數(shù)進(jìn)行加工炮制，并按《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)醋香附飲片進(jìn)行水分、灰分、醇浸出物測(cè)定，均合格。

表1 香附炮制品飲片評(píng)價(jià)咨詢表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與德爾菲評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 香附不同炮制品中α-香附酮和圓柚酮、5-HMF的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱定α-香附酮、圓柚酮對(duì)照品各5.00、2.16 mg于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容，制成含有α-香附酮200.0 μg/mL、圓柚酮86.4 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

精密稱取5-HMF對(duì)照品20.0 mg于50 mL量瓶中，加入80%甲醇，超聲溶解，定容，制成含5-HMF 400 μg/mL對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的配制 精密稱定香附不同炮制品粉末1.0 g（過(guò)四號(hào)篩）于錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）40 min，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇彌補(bǔ)減失的質(zhì)量，搖勻?yàn)V過(guò)，取適量續(xù)濾液離心5 min（12 000 r/min，離心半徑為66.5 mm），取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液[13-14]。

2.3.3 色譜條件

（1）α-香附酮和圓柚酮：色譜柱為Agilent HC- C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水（68∶32）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm；進(jìn)樣量5 μL。色譜圖見圖1。

（2）5-HMF：色譜柱為Agilent HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水（5∶95）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖2。

圖1 圓柚酮和α-香附酮混合對(duì)照品(A)和醋香附樣品(B) 的HPLC圖

圖2 5-HMF對(duì)照品(A)和醋香附樣品(B) 的HPLC圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 將“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液配制成α-香附酮質(zhì)量濃度為8.0、20.0、28.0、40.0、64.0、80.0 μg/mL，圓柚酮質(zhì)量濃度為3.456、8.640、12.100、17.280、27.650、34.560 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量5 μL；5-HMF對(duì)照品溶液配制成16.0、40.0、160.0、240.0、320.0、400.0 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10 μL；按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（）及線性范圍分別為α-香附酮＝14.924＋12.922，＝0.999 8，8.0～80.0 μg/mL；圓柚酮＝20.415＋2.804 7，＝0.999 8，3.456～34.560 μg/mL；5-HMF＝1210－20 223，＝0.999 8，16.0～400.0 μg/mL。

2.3.5 精密度考察 精密吸取α-香附酮、圓柚酮的混合對(duì)照品溶液，5-HMF對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得α-香附酮、圓柚酮、5-HMF峰面積的RSD分別為0.37%、1.23%、1.22%，結(jié)果表明該儀器系統(tǒng)精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取第10號(hào)香附供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法于制備后0、1、4、6、12、24 h時(shí)間點(diǎn)按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定供試品溶液中α-香附酮、圓柚酮、5-HMF的峰面積，計(jì)算得α-香附酮、圓柚酮、5-HMF峰面積的RSD分別為1.15%、1.79%、1.33%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性考察 精密稱取第10號(hào)香附樣品粉末6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算得α-香附酮、圓柚酮、5-HMF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.07%、2.18%、2.08%，結(jié)果表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率考察 精密稱定已測(cè)知α-香附酮、圓柚酮含量的香附粉末0.5 g（精密稱定已測(cè)知5-HMF含量的香附粉末0.5 g），共6份，分別加入α-香附酮、圓柚酮、5-HMF對(duì)照品200.0、86.4、800.0 μg，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，α-香附酮和圓柚酮、5-HMF的平均加樣回收率分別為99.58%、99.31%、101.58%，RSD分別為0.95%、0.84%、3.13%，結(jié)果表明該方法的加樣回收率良好。

2.3.9 α-香附酮、圓柚酮、5-HMF的含量測(cè)定 吸取“2.3.2”項(xiàng)下制備的香附供試品溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下確定的色譜條件，測(cè)定樣品中α-香附酮與圓柚酮、5-HMF峰面積，計(jì)算其含量，結(jié)果見表3。

表3 香附不同炮制品化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果

2.4 香附不同炮制品中總黃酮的含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定5.09 mg蘆丁對(duì)照品于50 mL量瓶中，加60%乙醇，超聲溶解，定容，即得對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱定香附不同炮制品粉末0.80 g（過(guò)四號(hào)篩）于150 mL錐形瓶中，加入60%乙醇20 mL，80 ℃水浴加熱回流提取2次，每次1.5 h，冷卻至室溫后，濾過(guò)，用60%乙醇沖洗濾渣，合并2次濾液，定容于50 mL量瓶中，搖勻，即得供試品溶液[15]。

2.4.3 供試品溶液的處理和測(cè)定波長(zhǎng)的確定 精密量取香附供試品溶液和蘆丁對(duì)照品溶液各2 mL，分別于10 mL量瓶中，加0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置5 min后，加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置5 min，加入4 mL 5%氫氧化鈉溶液，加入60%乙醇至刻度線，搖晃均勻，靜置10 min，以相應(yīng)的試劑為空白參比液，在400～700 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在507 nm處有最大吸收波長(zhǎng)[16-17]。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL量瓶中，加入60%乙醇定容，按“2.4.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），吸光度值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為＝0.016 8＋0.017，＝0.999 5，結(jié)果表明蘆丁在5.09～50.90 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度考察 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液2 mL，按照“2.4.3”項(xiàng)下方法處理，平行6次測(cè)定吸光度值，計(jì)算其RSD為0.15%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 精密量取第10號(hào)香附供試品溶液2 mL，按照“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液處理方法，室溫下于制備后0、5、10、20、30、60 min時(shí)測(cè)定供試品溶液的吸光度，計(jì)算其RSD為0.16%，結(jié)果表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性考察 精密稱取第10號(hào)香附供試品粉末6份，按照“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液的處理方法操作，測(cè)定6份樣品的吸光度值，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率考察 精密稱取已測(cè)知總黃酮含量的香附粉末0.50 g，共6份，精密加入質(zhì)量濃度為0.807 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液1.5 mL，按照“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液的處理方法操作，測(cè)定6份樣品的吸光度值，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果蘆丁的平均加樣回收率為99.84%，RSD為1.42%。

2.4.9 香附不同炮制品中總黃酮的含量測(cè)定 取香附不同炮制品粉末，按照“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液的處理方法操作，測(cè)定波長(zhǎng)507 nm處的吸光度值，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表3。

2.5 香附不同炮制品中粗纖維含量的測(cè)定[18-20]

取濾袋，質(zhì)量記為1，稱量約1.0 g干燥至恒定質(zhì)量的香附粉末裝于濾袋中稱定質(zhì)量為2，在距離濾袋口邊緣1 cm左右封口，將濾袋上端劃一小口固定在樣品支架上。將香附粉末放入消解罐中，加入2000 mL硫酸水解液進(jìn)行酸水解，設(shè)定消解時(shí)間45 min，消解溫度100 ℃。

消解時(shí)間結(jié)束后，將廢液排除，用超純水沖洗樣品及消解罐，再用2000 mL純水于100 ℃水洗10 min，重復(fù)洗滌至廢液pH值為中性；加入2000 mL氫氧化鈉水解液中進(jìn)行堿水解，溫度和時(shí)間與酸水解一致。

堿水解后，擠出濾袋中的水分，加入適量石油醚浸提30 min后，于通風(fēng)櫥中揮干石油醚。將揮干后的樣品烘干，稱定質(zhì)量為3。取烘干后的樣品于恒重的坩堝中，坩堝恒重質(zhì)量為4，放置在小型電熱爐上350 ℃預(yù)先炭化，將炭化后的樣品在馬弗爐中600 ℃灰化2 h，稱定質(zhì)量5，計(jì)算香附粉末中粗纖維含量{粗纖維含量＝[(3－1)－(5－4)]/ (2－1)}。粗纖維含量測(cè)定結(jié)果見表3。

2.6 香附不同炮制品中總揮發(fā)油含量的測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2015年版香附揮發(fā)油含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

2.7 醋香附炮制工藝的優(yōu)化

2.7.1 CRITIC法確定權(quán)重系數(shù) 采用CRITIC法對(duì)香附不同炮制品中的外觀性狀、化學(xué)成分含量進(jìn)行權(quán)重賦值，以期更客觀地反映實(shí)驗(yàn)情況，優(yōu)選香附炮制工藝。

將表3中的數(shù)據(jù)經(jīng)線性插值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)SPSS 20.0軟件處理得到相關(guān)系數(shù)矩陣，由C、W公式得到粗纖維、總黃酮、α-香附酮、圓柚酮、5-HMF、總揮發(fā)油含量及德爾菲評(píng)價(jià)總得分7項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為0.108 1、0.138 5、0.197 2、0.172 6、0.113 1、0.148 7、0.121 5。以綜合評(píng)分值（）對(duì)各項(xiàng)結(jié)果進(jìn)行加權(quán)。＝(1i/1max)×權(quán)重× 100＋(2i/2max)×權(quán)重×100＋…(6i/6max)×權(quán) 重×100，綜合評(píng)分值分別為82.294 7、75.218 3、73.060 0、78.289 4、80.200 4、81.687 8、76.353 5、76.066 4、76.141 9、81.396 8、74.322 9、72.405 0、81.867 2、80.894 5、82.580 2、80.363 9、81.462 5。

W＝C/C

δ為標(biāo)準(zhǔn)化之后各列指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差

2.7.2 多元二次效應(yīng)面回歸模型的建立與分析 以綜合評(píng)分為效應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，擬合出液體輔料（A）、炮制溫度（B）、炮制時(shí)間（C）與綜合評(píng)分（）的多項(xiàng)式方程為＝81.43－0.081 A－0.35 B－2.53 C＋3.08 AB－0.44 AC－1.79 BC－0.85 A2－3.36 B2－2.00 C2，該模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)見表4。由表4可知，本模型＜0.01，具有顯著性意義，結(jié)果中C為極顯著項(xiàng)，A、B為不顯著項(xiàng)；在交互項(xiàng)中，AB為極顯著項(xiàng)，BC為顯著項(xiàng)，AC為不顯著項(xiàng)；在二次項(xiàng)中，B2為極顯著項(xiàng)，C2為顯著項(xiàng)，A2為不顯著項(xiàng)?？偰Ｐ头匠虡O顯著（＝0.004 5＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（＝0.062 1＞0.05），相關(guān)系數(shù)2＝0.919 1，說(shuō)明該模型的回歸方程擬合度和可信度較好，實(shí)驗(yàn)誤差相對(duì)較小。

2.7.3 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測(cè) 根據(jù)上述回歸方程，繪制各影響因素交互作用的三維響應(yīng)曲面圖，見圖3。綜合評(píng)分值受到液體輔料（A）、炮制溫度（B）、炮制時(shí)間（C）的共同影響，炮制時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分值的影響最顯著。根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，最佳炮制工藝為液體輔料24.77%、炮制溫度138.84 ℃、炮制時(shí)間6.64 min，考慮到實(shí)際可操作性及設(shè)備的控溫精度，將最佳工藝調(diào)整為液體輔料25%，炮制溫度140 ℃，炮制時(shí)間7 min。

表4 方差分析結(jié)果

＜0.01，表明對(duì)綜合評(píng)分值有極顯著影響；＜0.05，表明對(duì)綜合評(píng)分值有顯著影響

< 0.01, which shows that it has a extremely significant effect on the comprehensive score value, and< 0.05, indicates that it has a significant effect on the comprehensive score value

2.7.4 工藝驗(yàn)證 取6份香附生品，按上述最佳炮制工藝條件炮制飲片，得到的醋香附飲片片型規(guī)整，顏色均勻，表面顏色棕褐色或深褐色，角質(zhì)樣，偶有焦斑，略有醋香氣。測(cè)得綜合評(píng)分值均值為81.50，與預(yù)測(cè)值相差較小，表明該工藝合理可行。工藝驗(yàn)證結(jié)果見表5、6。

2.8 物性參數(shù)與色度的測(cè)定

2.8.1 相對(duì)密度測(cè)定[21]精密稱量4.0 g醋香附飲片于盛有50 mL液體石蠟的量筒中，待凹液面穩(wěn)定時(shí)，記錄體積，平行測(cè)定3次。飲片相對(duì)密度＝飲片質(zhì)量/飲片的體積。結(jié)果見表7。

2.8.2 pH值測(cè)定[21]精密稱量5.0 g飲片，放入50 mL純化水中浸泡12 h，濾過(guò)，濾液搖晃均勻，平行測(cè)定3次，求平均值，即為飲片pH值。結(jié)果見表7。

2.8.3 吸水率測(cè)定 精密稱量5.0 g飲片，放入盛有50 mL純化水的量筒中，于24 h后將飲片取出，測(cè)定其吸水率。飲片吸水率＝飲片吸取水的質(zhì)量/飲片質(zhì)量。結(jié)果見表7。

圖3 各因素的三維效應(yīng)面

表5 工藝驗(yàn)證物性參數(shù)與色度測(cè)定結(jié)果

表6 工藝驗(yàn)證含量測(cè)定結(jié)果

Table 6 Process verification content determination results

2.8.4 氧化值的測(cè)定[22]參考文獻(xiàn)方法[22]，精密稱取香附炮制品4.0 g，測(cè)定氧化值。結(jié)果見表7。

2.8.5 飲片色度的測(cè)定 取中藥飲片將其均勻的鋪在透明玻璃板上，放置在薄層成像儀下，調(diào)至透色光模式，拍照，將拍好的照片經(jīng)過(guò)用Adobe Photoshop CS6軟件打開，選取拾色器，隨機(jī)多次取點(diǎn)，并記錄*、*、*的平均值，并用公式計(jì)算總色差（*）值[23-24]。色差公式為Δ*＝(*2＋*2＋*2)1/2。結(jié)果見表7。

2.9 化學(xué)成分與物性參數(shù)、色度之間的相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件，對(duì)物性參數(shù)、飲片色度與化學(xué)成分之間進(jìn)行秩檢驗(yàn)相關(guān)性分析，相關(guān)性數(shù)據(jù)見表8～10。結(jié)果表明，色度*值、色度Δ*值都與吸水率呈顯著正相關(guān)，與pH值、氧化值呈極顯著負(fù)相關(guān)；色度*值與吸水率呈顯著正相關(guān)，與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)，與氧化值呈顯著負(fù)相關(guān)。纖維含量與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)，與氧化值呈極顯著負(fù)相關(guān)，與相對(duì)密度呈顯著正相關(guān)；α-香附酮含量與pH值、氧化值呈極顯著正相關(guān)；圓柚酮含量與pH值、氧化值呈極顯著負(fù)相關(guān)。α-香附酮含量與*值、Δ*值呈顯著負(fù)相關(guān)，與*值呈極顯著負(fù)相關(guān)；圓柚酮含量與*值呈顯著正相關(guān)；總揮發(fā)油含量與*值、*值、Δ*值呈顯著負(fù)相關(guān)。

表7 香附不同炮炙品物性參數(shù)與色度測(cè)定結(jié)果

表8 物性參數(shù)與色度之間的相關(guān)性

*代表具有顯著性相關(guān)（＜0.05），**代表具有極顯著性相關(guān)（＜0.01），下表同

*representations have significant correlation (< 0.05), and**representations have extremely significant correlation (< 0.01), same as below tables

表9 物性參數(shù)與化學(xué)成分之間的相關(guān)性

表10 色度與化學(xué)成分之間的相關(guān)性

2.10 醋炙香附炮制終點(diǎn)的量化

通過(guò)以上相關(guān)性分析可知，pH值、氧化值是與醋香附內(nèi)在化學(xué)成分相關(guān)性最多、最顯著的兩個(gè)參數(shù)，說(shuō)明pH值、氧化值與醋香附內(nèi)在質(zhì)量具有一定的關(guān)聯(lián)性，因此，使用SPSS 20.0進(jìn)一步進(jìn)行線性回歸，得pH值（1）、氧化值（2）與粗纖維（1）、總黃酮（2）、α-香附酮（3）、圓柚酮（4）、5-HMF（5）、總揮發(fā)油（6）之間的多元線性回歸方程為1＝2.709－0.0221＋0.1182－0.0024－0.0365＋3.5106（2＝0.868），2＝103.146－2.231－2.8192－0.0123－0.4734＋0.5315＋32.6426（2＝0.624）。

且在工藝驗(yàn)證時(shí)，按最優(yōu)工藝炮制得到的6份醋香附飲片的pH值、氧化值范圍為4.462～4.678、21.076 8～22.429 2，故推測(cè)，若香附在醋炙時(shí)將其pH值、氧化值控制在此范圍內(nèi)，醋香附整體狀態(tài)即可達(dá)到最佳，但此結(jié)論僅由實(shí)驗(yàn)室理論數(shù)據(jù)得出，且批次較少，僅為醋香附炮制終點(diǎn)的量化進(jìn)行理論探索，后期會(huì)進(jìn)行多批次、工藝放大實(shí)驗(yàn)，更加科學(xué)合理的判定炮制終點(diǎn)，使醋香附的炮制工藝在生產(chǎn)實(shí)踐時(shí)真正做到標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)字化、可控化。

3 結(jié)論與討論

3.1 醋炙香附評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇

古人、老藥工對(duì)藥材及飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)，主要是通過(guò)對(duì)藥材及飲片的“形、色、氣、味”來(lái)實(shí)現(xiàn)，根據(jù)藥材外觀性狀所表現(xiàn)出的特點(diǎn)，來(lái)判斷藥材的真、偽、優(yōu)、劣，此法雖簡(jiǎn)便易行，但主觀性較強(qiáng)?，F(xiàn)行中藥質(zhì)量控制主要是通過(guò)單一的化學(xué)分析手段，即化學(xué)定性鑒別與指標(biāo)成分檢測(cè)，然而中藥化學(xué)成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)較多，以一種或多種活性成分作為檢測(cè)指標(biāo)還不能完全滿足中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的需求。因此，本實(shí)驗(yàn)從整體觀念出發(fā)，以“外觀形狀、內(nèi)在質(zhì)量”共同評(píng)價(jià)不同炮制工藝對(duì)醋炙香附整體質(zhì)量的影響。

德爾菲法，又稱專家調(diào)查法，特別適合各種經(jīng)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的繼承整理和規(guī)范化研究，目前在中藥傳統(tǒng)性狀鑒別領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[12]。讓老藥工對(duì)醋香附不同炮制品從“形狀、顏色、氣味、質(zhì)地、斷面”等感官指標(biāo)進(jìn)行打分，全面反映藥材的外觀性狀。香附內(nèi)在化學(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)代研究提示單用α-香附酮或木犀草素等黃酮類成分難以準(zhǔn)確表征香附特征, 更無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)香附的質(zhì)量[14]。故本課題從組織成分（粗纖維）、揮發(fā)性成分（α-香附酮、圓柚酮）、非揮發(fā)性成分（總黃酮）以及炮制過(guò)程中Maillard反應(yīng)的產(chǎn)物5-HMF，多種指標(biāo)共同表達(dá)香附炮制過(guò)后的內(nèi)在質(zhì)量。通過(guò)CRITIC客觀權(quán)重賦值，將主觀評(píng)價(jià)即外觀性狀與客觀評(píng)價(jià)即內(nèi)在質(zhì)量相結(jié)合，多指標(biāo)、綜合性、整體性的來(lái)評(píng)價(jià)醋炙香附不同炮制品，從而優(yōu)選出醋炙香附最佳炮制工藝。

Maillard反應(yīng)與中藥炮制息息相關(guān)，蒸、煮、煨、燙、鍛、炒等工藝方法均可導(dǎo)致Maillard反應(yīng)的發(fā)生。5-HMF是Maillard反應(yīng)的標(biāo)志性產(chǎn)物[23]，雖具有刺激性毒性但又具有抗氧化[25]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[26]等藥理活性。研究表明，5-HMF的含量與中藥炮制過(guò)程中的顏色變化具有顯著相關(guān)性，也是“焦香”氣味的來(lái)源之一，將5-HMF作為中藥炮制品的評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)炮制工藝及炮制機(jī)制的探究具有重要意義。

3.2 物性參數(shù)、飲片色度與化學(xué)成分含量的相關(guān)性分析

藥物經(jīng)炮制后，其化學(xué)成分及形色氣味質(zhì)等表觀指標(biāo)均有變化，而物性作為物質(zhì)的固有屬性，是傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)術(shù)語(yǔ)的客觀化，因此，本實(shí)驗(yàn)選取pH值、相對(duì)密度、吸水率、過(guò)氧化值4種常見并能明顯彰顯出飲片炮制前后差異性的物性指標(biāo)。

色度的*和*值決定了香附的色澤基調(diào)，而*值的變化決定了色澤的深淺。Δ*值是上述3個(gè)值的綜合表達(dá)，體現(xiàn)了人眼能夠鑒別色澤差異的能 力[27]。醋香附的pH值、吸水率、氧化值與色度*、*、Δ*具有顯著相關(guān)性，與*值無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明pH值、吸水率、氧化值對(duì)香附的黃藍(lán)色值以及色澤深淺影響較大，對(duì)香附的紅綠色值影響較小。炮制過(guò)程中，輔料醋的引入使香附的pH值發(fā)生改變，酸堿度的變化和高溫加熱促使美拉德反應(yīng)的發(fā)生，在這一反應(yīng)中，伴隨羰氨縮合及分子重排生成呈色呈香類物質(zhì)，故其氧化值、色澤發(fā)生變化，也是炙法炮制產(chǎn)生焦香氣味的原因。因此，pH值、吸水率、氧化值與色澤具有相關(guān)性，Maillard反應(yīng)為其主要緣由。由表10可知，美拉德反應(yīng)的標(biāo)志性產(chǎn)物5-HMF與色澤之間并無(wú)顯著相關(guān)性，查閱文獻(xiàn)，其原因可能有以下兩方面導(dǎo)致，一方面，前期研究發(fā)現(xiàn)炮制輔料米醋中含有5-HMF[28]，李震宇等[29]對(duì)米醋進(jìn)行1H-NMR分析，發(fā)現(xiàn)米醋中含有大量氨基酸、有機(jī)酸、糖類等，醋炙過(guò)程中，醋中的部分成分也會(huì)被藥材所吸收，故推測(cè)香附醋炙過(guò)程中5-HMF的來(lái)源途徑有2個(gè)，一為來(lái)源于米醋[3]，二為香附藥材中的游離氨基化合物（氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿）與羰基化合物（還原糖、脂質(zhì)、黃酮、揮發(fā)油等）在高溫加熱時(shí)發(fā)生Maillard反應(yīng)，產(chǎn)生5-HMF。另一方面，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)薄層成像儀測(cè)定飲片表面色澤，而飲片表面色澤與飲片內(nèi)部色澤是有區(qū)別的，所以本實(shí)驗(yàn)未能統(tǒng)計(jì)出色澤與5-HMF含量之間的相關(guān)性。

pH值、氧化值與α-香附酮含量呈極顯著正相關(guān)，與圓柚酮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；色澤*、*、Δ*與α-香附酮呈顯著負(fù)相關(guān)，色澤*與圓柚酮呈顯著正相關(guān)。說(shuō)明α-香附酮、圓柚酮的含量受pH值、氧化值、色澤的影響，在一定程度上，可建立pH值、氧化值、色澤與α-香附酮、圓柚酮的數(shù)學(xué)模型，用以指征α-香附酮、圓柚酮的含量高低。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of processing technology and processing end point ofwith vinegar based on multi-index response surface method

WEI Yu-die1, LI Qin1, SONG Chen-ge1, CHEN Tian-chao1, 2, MA Yan-jiang2

1. College of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China 2. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

To combine the subjective experience of quality evaluation of prepared slices with the objective index of chemical composition content to comprehensively evaluate the best processing technology ofprocessed with vinegar, and to quantify the judgment of processing end point.The processing technology of processedstir-frying with vinegar was designed based on Box-Behnken, and the appearance characters of different processed products were scored by Delphi evaluation. The total score of Delphi evaluation was taken as the subjective evaluation index, and the contents of fiber, α-cyperone, nootkatone, total flavonoids, 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) and total volatile oil were taken as the objective evaluation index. The CRITIC weight assignment method was used to combine the subjective and objective indexes. The best processing technology ofroasted with vinegar was optimized by response surface method. By measuring the physical property parameters and chromaticity of prepared slices, the correlation between physical parameters, chromaticity and the content of chemical components was established, and the indexes most related to the content of internal chemical components were found and used to quantify the processing end point.The best processing technology ofprocessed with vinegar was as follow: add 25% rice vinegar, spray evenly on the surface of the medicinal material with a graduated spray pot with 5 mL for each timefor 12 times, moisten for 8 h until no white heart in the medicinal material, and process 7 min at 140 ℃. pH value and oxidation value had significant negative correlation with chromaticityL,b, ΔE, water absorption had significant positive correlation with*,*, Δ*. Fiber content had significant negative correlation with pH value, oxidation value, and significant positive correlation with relative density. α-Cyperone content had extremely significant positive correlation with pH value and oxidation value, and significant negative correlation with*,*, Δ*. The content of nootkatone was significantly negatively correlated with pH value and oxidation value, and positively correlated with*value, while the total volatile oil content was significantly positively correlated with pH value and oxidation value, and negatively correlated with*,*, and Δ*value.The optimized processing technology ofis reasonable and feasible, and it is speculated that when the pH and oxidation value ofare controlled in the range of 4.462—4.678 and 21.076 8—22.429 2, the whole state ofcan be the best.

vinegar processed; processing technology; response surface methodology; physical parameters; Box-Behnken design; quality evaluation; quantification; Delphi evaluation; crude fiber; α-cyperone; nootkatone; flavonoids; 5-hydroxymethylfurfural; volatile oil; CRITIC weight assignment method; chromaticity

R283.1

A

0253 - 2670(2021)04 - 0982 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.010

2020-09-07

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地項(xiàng)目（國(guó)中醫(yī)藥規(guī)財(cái)發(fā)〔2015〕21號(hào)）；河南省中醫(yī)藥管理局國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地科研專項(xiàng)（2017JDZX007）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題（2018ZY1006）

位玉蝶（1994—），女，碩士研究生，中藥炮制及中藥新劑型。Tel:15290421037 E-mail: weiyd2018@163.com

陳天朝（1962—），男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，從事中藥炮制與中藥學(xué)研究。Tel: 13700845011 E-mail: ctc661111@163.com

馬彥江（1983—），男，主管中藥師，碩士學(xué)位，從事中藥炮制與中藥學(xué)。Tel: 15237118286 E-mail: 15237118286@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]