瑞香狼毒花中香豆素成分及生物活性研究

周蕙禎，羅 偉，陳 爽，陳胡蘭，李國友，李麗梅

瑞香狼毒花中香豆素成分及生物活性研究

周蕙禎1, 2，羅 偉2，陳 爽3，陳胡蘭2，李國友3，李麗梅1*

1. 西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137 3. 中國科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041

研究瑞香狼毒花中的香豆素類化學(xué)成分及其抗菌和抗氧化活性。綜合運(yùn)用多種色譜分離技術(shù)進(jìn)行分離純化，并采用現(xiàn)代波譜學(xué)分析技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。對分離得到的9個(gè)香豆素類化合物進(jìn)行了體內(nèi)外抗氧化活性和體外抗菌活性研究。首先，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP）法評價(jià)單體化合物抗氧化活性。然后用模式生物秀麗隱桿線蟲建立胡桃醌誘導(dǎo)氧化損傷應(yīng)激模型，通過H2DCFDA熒光染色實(shí)驗(yàn)，評價(jià)化合物9對氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲生存能力及體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響。此外，采用牛津杯法對單體化合物進(jìn)行抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的活性篩選。從瑞香狼毒花甲醇提取物中分離得到11個(gè)化合物，分別鑒定為7-羥基香豆素- 8--β--葡萄糖苷（1）、瑞香苷（2）、瑞香素（3）、7-羥基-8-甲氧基香豆素（4）、東莨菪葶（5）、5,7-二甲氧基香豆素（6）、傘形花內(nèi)酯（7）、白瑞香素（8）、雙白瑞香素（9）、3--咖啡酰奎尼酸（10）和腺苷（11）。化合物1、6、8、10、11為首次從該植物中分離得到，化合物11為首次從該屬植物中分離得到。體外抗氧化活性測試結(jié)果顯示化合物3和9活性顯著。體內(nèi)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)化合物9（28 μmol/L）能顯著延長線蟲在氧化應(yīng)激條件下的壽命（＜0.000 1），且可顯著降低線蟲體內(nèi)ROS水平（＜0.001），增強(qiáng)線蟲的抗氧化應(yīng)激能力。化合物9顯示出一定的大腸桿菌抑制活性，其最小抑菌濃度（MIC）值為1.0 mg/mL。

瑞香狼毒花；香豆素；抗氧化活性；抗菌活性；秀麗隱桿線蟲；5,7-二甲氧基香豆素；白瑞香素；雙白瑞香素；3--咖啡?？崴?；腺苷

瑞香狼毒L.是瑞香科（Thymelaeaceae）狼毒屬Linn.植物，又名續(xù)毒、山蘿卜、生扯攏等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為中藥狼毒之正品，主要藥用部位為根[1]。瑞香狼毒性味辛、苦、平，歸肺、脾、肝經(jīng)，有毒，有瀉水逐飲、破積殺蟲之效[1]。國內(nèi)外學(xué)者對瑞香狼毒根莖中的化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)了雙黃酮、木脂素、香豆素、二萜類等成分，香豆素是其中的特征性化學(xué)成分，目前有關(guān)瑞香狼毒花的研究并不多見[2-3]。近年來，大量研究主要集中于具有強(qiáng)毒及抗腫瘤活性的二萜原酸酯類和雙黃酮類成分，而對香豆素及雙香豆素類特征性成分活性研究較少[4-5]。香豆素類化合物廣泛分布于多種植物中，大量實(shí)驗(yàn)研究顯示其具有抗凝血、抑菌等多種生物活性，廣泛用于多種領(lǐng)域，以醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最常用[6]。香豆素相對分子質(zhì)量較小，毒性較小，大部分香豆素類化合物吸收較快、生物利用度高，且已有雙香豆素類成分作為抗凝藥物在臨床使用，故香豆素類成分已經(jīng)成為藥物研發(fā)的重要方向之一[6-7]。

本課題組前期開展了瑞香狼毒花部位中木脂素及黃酮類化學(xué)成分和體外抗氧化活性的研究[3]，為了更全面地研究和闡明瑞香狼毒的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，深入挖掘其藥用價(jià)值，更好地開發(fā)利用該藥用植物資源，本研究以瑞香狼毒花為研究對象，對其中的香豆素類成分進(jìn)行了研究，從其甲醇提取物中分離鑒定了9個(gè)香豆素類化合物和2個(gè)其他類化合物，依次為7-羥基香豆素-8--β--葡萄糖苷（7- hydroxycoumarin-8--β--glucopyranoside，1）、瑞香苷（daphnin，2）、瑞香素（daphnetin，3）、7-羥基-8-甲氧基香豆素（7-hydroxy-8-methoxycomarin，4）、東莨菪葶（scopoletin，5）、5,7-二甲氧基香豆素（5,7-dimethoxycoumarin，6）、傘形花內(nèi)酯（umbelliferone，7）、白瑞香素（edgeworthin，8）、雙白瑞香素（daphnoretin，9）、3--咖啡酰奎尼酸（3--caffeoylquinic acid，10）和腺苷（adenosine，11）。其中化合物1、6、8、10、11為首次從該植物中分離得到，化合物11為首次從該屬植物中分離得到。鑒于既往研究表明瑞香狼毒具有殺蟲、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗驚厥等多種藥理活性，本研究分別采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP）法和牛津杯法篩選香豆素類化合物1～9體外抗氧化與抗菌活性，結(jié)果表明化合物3和9表現(xiàn)出顯著的體外抗氧化活性，進(jìn)一步以模式生物秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激模型探討化合物9體內(nèi)抗氧化活性；抗菌活性實(shí)驗(yàn)中，化合物9顯示出一定的抗大腸桿菌活性，其最小抑菌濃度（MIC）值為1.0 mg/mL。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Ascend 400 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；ODS C18填料（日本YMC公司）；Sephadex LH-20（GE Healthcare公司）；制備色譜柱（ODS，20 mm×10 mm，10 μm），蘇州納微科技股份有限公司；LC-P100高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；M5型酶標(biāo)儀（Molecular Device美國公司）；薄層色譜板、柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；D101 大孔樹脂（成都科龍化工試劑廠）；Nikon- Eclipse Ti-E熒光倒置顯微鏡；96孔培養(yǎng)板（北京東方大林科技有限公司）。胡桃醌購自美國Sigma- Aldrich公司，其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.2 藥材、供試蟲源與菌種

實(shí)驗(yàn)所用藥材購自成都市荷花池藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)王光志教授鑒定為瑞香科狼毒屬植物瑞香狼毒L.的花，標(biāo)本（LMSC201801）保存在西南民族大學(xué)藥學(xué)院。秀麗隱桿線蟲野生N2來自美國明尼蘇達(dá)大學(xué)線蟲遺傳學(xué)中心（Caenorhabditis Genetics Center）?？咕钚院Y選所用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌4種菌種保存于中國科學(xué)院成都生物研究所。

2 方法

2.1 提取與分離

取干燥的瑞香狼毒花5.0 kg，粉碎后，用純甲醇50 ℃回流提取3次，每次3 h，濾過，合并提取液，減壓回收后得到總浸膏500.0 g。將總浸膏以溫水分散后，依次用醋酸乙酯和正丁醇等體積萃取，分別得到醋酸乙酯部位148.3 g和正丁醇部位113.3 g。正丁醇部位浸膏（113.3 g）經(jīng)大孔樹脂DH-101，甲醇-水（0∶100→100∶0）梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并得到4個(gè)組分Fr. 1～4。Fr. 1（3.0 g）經(jīng)ODS C18柱色譜，甲醇-水（10∶100→100∶0）梯度洗脫，其中20%甲醇洗脫部位經(jīng)制備HPLC分離（13%乙腈，8 mL/min，254 nm）得到化合物1（20 mg，R＝18 min）、10（20 mg，R＝15 min），40%甲醇洗脫部位經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（甲醇）分離得到化合物2（0.4 g）和3（1.0 g）。Fr. 3（18.6 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜（200～300目），二氯乙烷-甲醇（50∶1→1∶1）梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并為3個(gè)組分Fr. 3-1～3-3。Fr. 3-1（10.0 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜（200～300目），二氯乙烷-甲醇（25∶1→1∶1）洗脫，洗脫流分經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（甲醇）分離后，重結(jié)晶得到化合物4（8 mg）和5（10 mg）。Fr. 4（8.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目），二氯乙烷-甲醇（50∶1→1∶1）洗脫，TLC檢測合并得到4個(gè)組分Fr. 4-1～4-4，F(xiàn)r. 4-1（0.6 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜[氯仿-甲醇（1∶1）]和制備HPLC分離（33%乙腈，8 mL/min，254 nm）分離得到化合物8（15 mg，R＝16 min）。醋酸乙酯部位浸膏（148.3 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜（200～300目），二氯乙烷-甲醇（100∶1→0∶1）梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并得到5個(gè)組分，即Fr. 5～9。Fr. 5（1.0 g）經(jīng)二次硅膠柱色譜（200～300目），二氯乙烷-甲醇（60∶1→10∶1）梯度洗脫，TLC檢測后合并為3個(gè)組分Fr. 5-1～5-3。Fr. 5-1（0.1 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜[氯仿-甲醇（1∶1）]分離后，重結(jié)晶得到化合物6（10 mg）和7（20 mg）。Fr. 5-3（0.7 g）經(jīng)制備HPLC分離（35%乙腈，8 mL/min，254 nm）得到化合物9（0.5 g，R＝16 min）。Fr. 6經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜[氯仿-甲醇（1∶1）]分離得到化合物11（10 mg）。

2.2 體外抗氧化與抗菌活性測試

2.2.1 FRAP法測定總抗氧化能力 總抗氧化能力檢測參照文獻(xiàn)采用FRAP法[8]，總抗氧化能力用FRAP表示。

FRAP工作液的配制：pH 3.6的醋酸緩沖液、10.0 mmol/L Fe3+-三吡啶三嗪（TPTZ）溶液和20.0 mmol/L FeCl3溶液按比例10∶1∶1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。FRAP工作液配制后37 ℃水浴15 min，并于3 h內(nèi)使用完畢。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：于96孔板中依次加入濃度為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液5.0 μL，加入180.0 μL FRAP工作液，混勻后37 ℃孵育10 min，于593 nm處測定吸光度（），由值（）與硫酸亞鐵濃度（）得到線性回歸方程＝1.156 4＋0.120 2，2＝0.998。

取化合物按照上述方法測定值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品FRAP值。

2.2.2 DPPH法測定自由基清除率 DPPH自由基清除率測定參照文獻(xiàn)方法[8]進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取DPPH 2.0 mg，以甲醇溶解，配制成0.2 mol/L DPPH貯備液，避光冷藏備用。選取維生素C（Vc）為陽性對照，準(zhǔn)確稱取1.0 mg Vc和樣品溶解于DMSO中，稀釋成系列濃度（100.00～0.05 μmol/L）溶液，備用。DPPH貯備液使用時(shí)用甲醇稀釋，在517 nm處測得值為（0.45±0.05）～（0.80±0.05）。取100.0 μL DPPH貯備液加至96孔板中，再向各孔中加入一系列樣品溶液和陽性對照溶液，室溫黑暗中放置30 min，反應(yīng)完全后用酶標(biāo)儀在517 nm處測定值（每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值）。樣品對DPPH自由基清除率按照公式計(jì)算，DPPH的清除能力用半數(shù)抑制濃度（IC50）表示。

DPPH清除率＝[0－(－1)]/0

0為未加樣品的DPPH值，為樣品與DPPH反應(yīng)后的值，1為溶劑與DPPH的值

2.2.3 ABTS?+法測定自由基清除率 ABTS?+自由基清除率測定參照文獻(xiàn)方法[8]測定。ABTS?+工作母液：分別量取7.0 mmol/L ABTS?+溶液和2.45 mmol/L 過硫酸鉀水溶液1 mL，兩者等體積混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h。ABTS?+工作液用甲醇稀釋30～60倍，在734 nm處測定值為（0.45±0.05）～（0.80±0.05）。取100.0 μL ABTS?+工作液加至96孔板中，再向各孔中加入一系列樣品溶液（100.0～0.05 μmol/L）和陽性對照（Vc）溶液，避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)完全后用酶標(biāo)儀在734 nm處測定值（每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值）。樣品對ABTS?+自由基清除率按照公式計(jì)算，ABTS?+的清除能力用IC50表示。

ABTS?+清除率=[0－(－1)]/0

0為未加樣品的ABTS?+的值，為樣品與ABTS?+反應(yīng)后的值，1為溶劑與ABTS?+的值

2.2.5 牛津杯法測試抗菌活性 實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法[9]對化合物1～9進(jìn)行抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌的活性篩選，將樣品溶于DMSO，加入對應(yīng)的牛津杯中，并以DMSO為陰性對照，置于恒溫培養(yǎng)箱（細(xì)菌37 ℃，真菌30 ℃）培養(yǎng)12～24 h后，檢查抑菌圈的有無。并通過倍比稀釋法測定具有一定抗菌活性化合物的MIC值。

2.3 體內(nèi)抗氧化活性測試

2.3.1 線蟲同期化及壽命實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)方法[10-12]，秀麗隱桿線蟲N2株系于線蟲培養(yǎng)基（NGM）固體培養(yǎng)基上20 ℃培養(yǎng)，NGM固體培養(yǎng)基上涂布大腸桿菌OP50作為線蟲食物來源。將處于產(chǎn)卵期的秀麗線蟲用M9緩沖液洗滌收集，采用Bleach裂解法對秀麗線蟲進(jìn)行同期化處理，處理后洗滌收集蟲卵，加M9緩沖液后置于恒溫?fù)u床（20 ℃）同步培養(yǎng)12 h，待蟲卵孵化至L1期后轉(zhuǎn)移至新的NGM固體培養(yǎng)基。

NGM的配制：稱取1.2 g NaCl、1.0 g蛋白胨、7.0 g瓊脂溶于400 mL水中，高壓滅菌后待溫度降至60～65 ℃，加入400 μL抽濾除菌的K2HPO4/ KH2PO4緩沖液（1 mol/L）、MgSO4（1 mol/L）、CaCl2（1 mol/L）及膽固醇溶液（0.01 mol/L）。

M9緩沖液的配制：稱取3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4和5 g NaCl溶于1 L超純水中，最后加入1 mL 1 mmol/L MgSO4。

實(shí)驗(yàn)分為對照組和給藥組，實(shí)驗(yàn)中給予線蟲的藥物及對照組處理均為直接添加入NGM固體培養(yǎng)基，每組3個(gè)平行板，每板約50條，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從其進(jìn)入產(chǎn)卵期起，每24小時(shí)將其轉(zhuǎn)至新的已涂布OP50的NGM固體培養(yǎng)基中，至非產(chǎn)卵期后，隔天轉(zhuǎn)板1次，直至各組秀麗線蟲全部死亡，以秀麗線蟲個(gè)體對機(jī)械性刺激無反應(yīng)視為死亡，鉆入瓊脂內(nèi)或逃至皿蓋而干死不計(jì)入內(nèi)。

參考文獻(xiàn)方法[10-12]，初篩實(shí)驗(yàn)分為低、中、高劑量（5、17、28 μmol/L）組和對照組（M9緩沖液），低、中劑量組與對照組無明顯差異，故僅采用高劑量組（28 μmol/L）進(jìn)一步測試其抗氧化應(yīng)激能力與線蟲體內(nèi)ROS水平。

2.3.2 胡桃醌誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激模型的建立及其壽命測試 參考文獻(xiàn)方法[10-11]，線蟲同期化處理同“2.3.1”項(xiàng)，待測藥物用20.0 μL DMSO溶解后加入S-bassal液體培養(yǎng)基中（終濃度28 μmol/L），實(shí)驗(yàn)分為對照組（20.0 μL DMSO）、模型組（胡桃醌250 μmol/L）和給藥組（化合物9 28 μmol/L）。秀麗線蟲孵育至L1期，將線蟲轉(zhuǎn)移至含藥S-bassal液體培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床20 ℃培養(yǎng)72 h，離心制備線蟲懸濁液，并于顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整線蟲懸濁液至每約30條/100 μL。取96孔板，每孔加入100 μL線蟲懸濁液及胡桃醌（終濃度250 μmol/L）處理3 h，每隔1在顯微鏡下計(jì)線蟲存活數(shù)，直至所有實(shí)驗(yàn)組的線蟲全部死亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.3 胡桃醌誘導(dǎo)的秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激模型體內(nèi)ROS水平檢測 參考文獻(xiàn)方法[10-11]，實(shí)驗(yàn)分為模型組和給藥組（28 μmol/L化合物9），胡桃醌誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激模型同“2.3.2”項(xiàng)，加入2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）熒光探針，使其終濃度50 μmol/L，20 ℃孵育2.5 h，將線蟲挑至1%瓊脂制片的載玻片中，于熒光顯微鏡（激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長530 nm）下觀察拍照。

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以Image-Pro Plus軟件分析染色線蟲圖像，并測量熒光密度。采用Graphpad Prism 5.0軟件對線蟲進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，兩組間比較采用檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（甲醇），ESI-MS/: 341.28 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.94 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 7.31 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 6.87 (1H, d,= 8.5 Hz, H-6), 6.23 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3), 4.96 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 3.61～3.16 (6H, m, H-2′～6′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.3 (C-2), 153.9 (C-7), 148.2 (C-9), 145.2 (C-4), 131.6 (C-8), 124.5 (C-5), 113.7 (C-3), 112.6 (C-10), 112.1 (C-6), 104.4 (C-1′), 77.7 (C-3′), 76.8 (C-5′), 74.4 (C-2′), 70.4 (C-4′), 61.6 (C-6′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物1為7-羥基香豆素-8--β--葡萄糖苷。

化合物2：白色針晶（甲醇），ESI-MS/: 363.28 [M＋Na]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.96 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 7.13 (2H, overlapped, H-5, 6), 6.32 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3), 5.15 (1H, d,= 4.7 Hz, H-1′), 5.10 (1H, d,= 7.4 Hz, H-6′α), 4.86 (1H, d,= 7.4 Hz, H-6′β), 4.64 (1H, t,= 5.0 Hz, H-2′), 3.77 (1H, m, H-5′), 3.48 (1H, m H-4′), 3.23 (1H, m, H-3′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.1 (C-2), 148.2 (C-7), 144.7 (C-4), 142.6 (C-9), 133.9 (C-8), 118.3 (C-5), 114.5 (C-10), 113.4 (C-3), 112.1 (C-6), 101.8 (C-1′), 77.3 (C-3′), 75.7 (C-5′), 73.3 (C-2′), 69.7 (C-4′), 60.7 (C-6′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物2為瑞香苷。

化合物3：淡黃色針晶（甲醇），ESI-MS/: 179.10 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.89 (1H, d,= 9.4 Hz, H-4), 7.01 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 6.79 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 6.18 (1H, d,= 9.4 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.3 (C-2), 149.7 (C-7), 145.0 (C-4), 143.7 (C-9), 132.1 (C-8), 118.8 (C-5), 112.8 (C-6), 112.0 (C-10), 111.1 (C-3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物3為瑞香素。

化合物4：黃色簇晶（甲醇），ESI-MS/: 191.05 [M－H]?。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.63 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 7.11 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 6.89 (1H, d,= 8.5 Hz, H-6), 6.24 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3), 4.10 (3H, s, 8-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 160.2 (C-2), 151.9 (C-7), 147.0 (C-9), 144.2 (C-4), 133.4 (C-8), 123.1 (C-5), 113.0 (C-10), 112.2 (C-3), 112.0 (C-6), 61.3 (8-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物4為7-羥基-8-甲氧基香豆素。

化合物5：淡黃色針晶（二氯乙烷-甲醇），ESI-MS/: 191.17 [M－H]?。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.91 (1H, d,= 9.4 Hz, H-4), 7.22 (1H, s, H-5), 6.78 (1H, s, H-8), 6.21 (1H, d,= 9.4 Hz, H-3), 3.81 (3H, s, 6-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.8 (C-2), 151.6 (C-7), 149.5 (C-9), 145.3 (C-6), 144.6 (C-4), 111.7 (C-10), 110.6 (C-5), 107.5 (C-3), 102.7 (C-8), 56.0 (6-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物5為東莨菪葶。

化合物6：淡黃色針晶（二氯乙烷-甲醇），ESI-MS/: 207.19 [M＋H]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3): 8.09 (1H, d,= 9.8 Hz, H-4), 7.66 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 7.09 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 6.37 (1H, d,= 9.8 Hz, H-3), 4.15 (3H, s, 7-OCH3), 4.03 (3H, s, 5-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 145.5 (C-8), 140.2 (C-4), 113.8 (C-3), 104.6 (C-6), 62.5 (5-OCH3), 61.3 (7-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物6為5,7-二甲氧基香豆素。

化合物7：淡黃色針晶（二氯乙烷-甲醇），ESI-MS/: 163.4 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.93 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 7.52 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 6.78 (1H, dd,= 8.5, 2.2 Hz, H-6), 6.71 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.2 (C-2), 160.1 (C-7), 155.4 (C-9), 144.5 (C-4), 129.6 (C-5), 113.0 (C-6), 111.2 (C-10), 111.3 (C-3), 103.1 (C-8)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物7為傘形花內(nèi)酯。

化合物8：淡黃色粉末（二氯乙烷-甲醇），ESI-MS/: 339.01 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 8.02 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 7.88 (1H, s, H-4′), 7.69 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 7.13 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 7.08 (1H, dd,= 8.5, 2.2 Hz, H-6), 6.99 (1H, s, H-5′), 6.82 (1H, s, H-8′), 6.36 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.1 (C-2), 159.9 (C-2′), 157.2 (C-7), 155.1 (C-9), 149.8 (C-9′), 146.6 (C-7′), 144.2 (C-6′), 143.5 (C-4), 135.4 (C-3′), 131.5 (C-4′), 129.9 (C-5), 114.4 (C-10), 113.9 (C-3), 113.4 (C-6), 112.3 (C-5′), 110.5 (C-10′), 103.8 (C-8′), 102.7 (C-8)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物8為白瑞香素。

化合物9：白色羽狀晶體（二氯乙烷），ESI-MS/: 353.02 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 8.04 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 7.87 (1H, s, H-4′), 7.71 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 7.21 (1H, s, H-5′), 7.19 (1H, d,= 2.4 Hz, H-8), 7.11 (1H, dd,= 8.6, 2.4 Hz, H-6), 6.86 (1H, s, H-8′), 6.38 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3), 3.81 (3H, s, 6-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 159.8 (C-2), 159.8 (C-2′), 156.9 (C-7), 154.9 (C-9), 150.3 (C-9′), 147.4 (C-7′), 145.6 (C-6′), 143.9 (C-4), 135.7 (C-3′), 130.7 (C-4′), 129.8 (C-5), 114.3 (C-10), 113.8 (C-3), 113.4 (C-6), 110.1 (C-10′), 109.5 (C-5′), 103.9 (C-8′), 102.7 (C-8), 58.0 (6-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物9為雙白瑞香素。

化合物10：淡黃色粉末（甲醇），ESI-MS/: 353.37 [M－H]?。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.42 (1H,= 15.9 Hz, H-7′), 7.05 (1H, s, H-2′), 6.98 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6′), 6.76 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 6.15 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8′), 5.06 (1H, d,= 4.2 Hz, H-3), 3.92 (1H, dd,= 8.4, 5.1 Hz, H-4), 3.60 (1H, m, H-5), 2.09～1.69 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 175.9 (C-7, COOH), 166.9 (C-9′), 148.8 (C-4′), 145.9 (C-7′), 145.8 (C-3′), 125.9 (C-1′), 121.1 (C-6′), 116.6 (C-5′), 115.4 (C-2′), 74.0 (C-1), 71.9 (C-4), 71.1 (C-3), 68.3 (C-5), 37.9 (C-2), 37.6 (C-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物10為3--咖啡?？崴?。

化合物11：白色粉末（甲醇）。ESI-MS/: 268.04 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 8.35 (1H, s, H-8), 8.13 (1H, s, H-2), 7.35 (2H, s, NH2), 5.87 (1H, d,= 6.2 Hz, H-1′), 5.44 (2H, m, 2′, 5′-OH), 5.20 (1H, brs, 3′-OH), 4.60 (1H, d,= 5.2 Hz, H-2′), 4.14 (1H, brs, H-3′), 3.96 (1H, d,= 3.1 Hz, H-4′), 3.65 (1H, m, H-5′a), 3.55 (1H, m, H-5′b)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 156.6 (C-6), 152.8 (C-2), 149.5 (C-4), 140.4 (C-8), 119.8 (C-5), 88.4 (C-1′), 86.4 (C-4′), 73.9 (C-2′), 71.1 (C-3′), 62.1 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，故鑒定化合物11為腺苷。

3.2 體外抗氧化與抗菌活性結(jié)果

3.2.1 FRAP、DPPH、ABTS法抗氧化活性測試結(jié)果 采用3種不同的評價(jià)體系對分離得到的香豆素類化合物進(jìn)行了體外抗氧化活性測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示化合物3、9的DPPH、ABTS清除能力均優(yōu)于陽性對照Vc，總抗氧化能力大于其他化合物。說明化合物3、9體外抗氧化能力顯著。

3.2.2 抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物9顯示出一定的抗大腸桿菌活性，其余化合物未顯示出明顯活性。通過連續(xù)倍比稀釋法測定化合物9的MIC值為1.0 mg/mL。

表1 化合物1～4、7～9的抗氧化活性

3.3 體內(nèi)抗氧化活性測試結(jié)果

3.3.1 化合物9對野生型秀麗隱桿線蟲壽命的影響 依據(jù)體外抗氧化活性測試結(jié)果，以秀麗線蟲為模型，采用胡桃醌（終濃度250 μmol/L）誘導(dǎo)線蟲急性氧化損傷模型評價(jià)其體內(nèi)抗氧化活性。如圖1所示，與對照組相比，化合物9（28 μmol/L）對線蟲壽命無明顯影響，而化合物9預(yù)處理的線蟲在急性氧化應(yīng)激條件下壽命明顯提高，通過Log-rank（Mantel-Cox）計(jì)算，化合物9與模型組存在顯著差異（＜0.000 1）。

3.3.2 化合物9對氧化應(yīng)激狀態(tài)線蟲體內(nèi)ROS水平的影響 實(shí)驗(yàn)采用熒光探針H2DCFDA標(biāo)記秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS，ROS水平越高，熒光強(qiáng)度越大，相對熒光密度越大。結(jié)果表明（圖2），與對照組（熒光密度146.40±10.32）相比，化合物9（28 μmol/L）作用后的線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度（熒光密度值117.23±11.93）降低，ROS水平降低，且兩組數(shù)據(jù)有極顯著差異（＜0.01），表明28 μmol/L的化合物9能夠抑制線蟲體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，對氧化損傷的線蟲具有保護(hù)作用。

A-化合物9對正常狀態(tài)下線蟲壽命的影響 B-化合物9對氧化應(yīng)激條件下線蟲壽命的影響

A-氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平 B-化合物9作用后氧化應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平 C-各組相對熒光密度值，與模型組比較:**P＜0.01

4 討論

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)（DPPH、ABTS、FRAP）方便快速，但測試環(huán)境與動物體內(nèi)氧化環(huán)境不同，很難僅通過體外實(shí)驗(yàn)來評價(jià)化合物的抗氧化能力。因此，本研究采用體內(nèi)外抗氧化評價(jià)體系綜合評價(jià)單體化合物的抗氧化活性。

3種體外抗氧化活性測試結(jié)果具有一致性，化合物3、9的自由基清除能力優(yōu)于或約等于陽性對照Vc，表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化活性。體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)顯示化合物9能顯著延長氧化應(yīng)激條件下線蟲的壽命，且可顯著降低應(yīng)激狀態(tài)下線蟲體內(nèi)ROS水平，增強(qiáng)線蟲的抗氧化應(yīng)激能力。體內(nèi)抗氧化活性結(jié)果與體外抗氧化活性測試結(jié)果一致，表明化合物9具有較強(qiáng)的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙香豆素具有一定體內(nèi)外抗氧化活性，具體的作用機(jī)制尚需深入研究。

隨著研究的深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的許多疾病均與自由基或者人體氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，包括腫瘤、血管動脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)、阿爾茨海默病、衰老等，因而抑制自由基的產(chǎn)生、清除自由基的方法越來越受到重視。同時(shí)，已有臨床采用自由基清除劑作為輔助治療的手段，也有相關(guān)文獻(xiàn)表明香豆素抗腫瘤、抗炎作用與其抗氧化作用有關(guān)[20-22]。現(xiàn)代藥理研究[5]表明瑞香狼毒具有一定的抑菌活性，許多香豆素類成分與抑菌活性相關(guān)[6-7]，本研究初步篩選了瑞香狼毒中香豆素類成分對4種菌的抑菌作用，豐富了該植物化學(xué)成分與生物活性研究內(nèi)容，為臨床合理用藥提供了一定參考，同時(shí)對闡明其藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，擴(kuò)大瑞香狼毒藥用部位，進(jìn)一步開發(fā)利用瑞香狼毒植物資源具有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Coumarins from flowers ofand their biological activities

ZHOU Hui-zhen1, 2, LUO Wei2, CHEN Shuang3, CHEN Hu-lan2, LI Guo-you3, LI Li-mei1

1. School of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China 2. Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicines, Ministry of Education, State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Co-construction by Province and Ministry, College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China

To study the coumarins from the flowers ofand their antioxidant and antimicrobial activities.The chemical constituents were isolated by column chromatography packed with macroporous resin DH-101, silica gel, Sephadex LH-20, and ODS C18 silica gel, respectively, and the structures of the purified compounds were elucidated on the basis of spectroscopic analyses. Firstly, theantioxidant activities of compounds 1-9 were evaluated by DPPH, ABTS, and FRAP assays. Then, theantioxidant activity of compound 9 was further investigated on model organismstrain N2, which was evaluated by the survival ofunder juglone-induced oxidative stress and the intracellular ROS level ofwas determined by H2DCFDA. Moreover, the activities of compounds 1-9 against,,, andwere studied by oxford cup method.The structures of compounds 1-11 were respectively identified as 7-hydroxycoumarin-8--β--glucopyranoside (1), daphnin (2), daphnetin (3), 7-hydroxy-8-methoxycomarin (4), scopoletin (5), 5,7-dimethoxycoumarin (6), umbelliferone (7), edgeworthin (8), daphnoretin (9), 3--caffeoylquinic acid (10), and adenosine (11). Compounds 1, 6, 8, 10 and 11 are obtained from this plant for the first time. Compound 11 is firstly isolated from.Compounds 3 and 9 showed significant antioxidant activity. And compound 9 (28 μmol/L) significantly increased the lifespan (< 0.0001) and attenuated the ROS accumulation inunder oxidative stress (< 0.01). Meanwhile, compound 9 showed moderate activity againstwith the MIC value of 1.0 mg/mL.

flowers ofL.; coumarin; antioxidant activity; antimicrobial activity;; 5,7-dimethoxycoumarin; edgeworthin; daphnoretin; 3--caffeoylquinic acid; adenosine

R284.1

A

0253 - 2670(2021)04- 0943 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.006

2020-09-27

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2020NTD05）；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（2016TD0006）

周蕙禎，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)橹兴幱行С煞址治?。E-mail: 1312161673@qq.com

李麗梅，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幖懊褡逅幍难芯颗c開發(fā)。E-mail: limeili@swun.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]