全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油成分的分析

陳嘯天，肖雪，錢(qián)沉魚(yú)，宋居易，向章敏*

(1.廣東省測(cè)試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070；2.貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，貴陽(yáng) 551000)

砂仁(Amomumvillosum)，是姜科、豆蔻屬草本植物陽(yáng)春砂、海南砂或綠殼砂的干燥成熟果實(shí)[1]，屬“藥食同源”收錄藥材，其粉末也常做調(diào)味料使用。各產(chǎn)地中以廣東省陽(yáng)春市地區(qū)所產(chǎn)陽(yáng)春砂最為知名。近年來(lái)其主產(chǎn)區(qū)已轉(zhuǎn)移至廣西和云南等地，但道地性仍以原產(chǎn)地陽(yáng)春市為佳。砂仁含有大量揮發(fā)油且氣味濃郁，已有研究表明揮發(fā)油是砂仁的主要活性成分[2-3]，能顯著抑制胃液胃酸的分泌，從而防止?jié)兊男纬蒣4]，同時(shí)還具有抗菌消炎和鎮(zhèn)痛等作用[5-6]，因而具有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。目前已有較多文獻(xiàn)采用一維氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析砂仁揮發(fā)油的化學(xué)成分[7-8]，但砂仁揮發(fā)油作為天然產(chǎn)物，存在大量同分異構(gòu)體及結(jié)構(gòu)相似的化合物，傳統(tǒng)的一維色譜檢測(cè)存在一定的局限性[9]，而全二維氣相色譜作為近年來(lái)興起的分離檢測(cè)技術(shù)，它采用兩根極性不同的色譜柱分別根據(jù)沸點(diǎn)和極性對(duì)物質(zhì)進(jìn)行正交分離，與傳統(tǒng)一維氣相色譜相比具有更好的分離度和更大的峰容量，同時(shí)由于調(diào)制器的聚焦作用，檢測(cè)的靈敏度也得到了加強(qiáng)，非常適宜用于砂仁揮發(fā)油化學(xué)成分的分離鑒定。同時(shí)蒸餾萃取法耗能少且效率高[10]，而飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度高且速度快，故本實(shí)驗(yàn)采用同時(shí)蒸餾萃取法提取砂仁的揮發(fā)油，并比較了相同進(jìn)樣條件下一維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜和全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)利用后者對(duì)來(lái)自廣東陽(yáng)春、廣西南寧和云南文山的樣品進(jìn)行了分析，探討了砂仁揮發(fā)油成分的成分差異和產(chǎn)地特征，為砂仁資源的綜合利用提供了科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯化鈉(AR)、二氯甲烷(AR)：廣州化學(xué)試劑廠。

FW100型中草藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；HH-2型水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；低溫冷卻循環(huán)泵 鄭州豫華儀器制造有限公司；ZNHW型電熱套 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7890B GC/7250 QTOF型氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；SSM1800型固態(tài)熱調(diào)制器 雪景電子科技(上海)有限公司。

1.2 樣品來(lái)源

實(shí)驗(yàn)用的砂仁樣品分別采集來(lái)自于廣東、云南、廣西3個(gè)不同產(chǎn)地的兩批次樣品。將干燥的砂仁果實(shí)樣品用四分法縮分，然后用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩備測(cè)。

1.3 樣品前處理

稱(chēng)取30 g過(guò)60目篩的干燥砂仁樣品，倒入同時(shí)蒸餾萃取裝置一端的1000 mL平底燒瓶中，加入50 g 氯化鈉和300 mL蒸餾水，電熱套加熱。裝置另一端接100 mL燒瓶，加入60 mL 二氯甲烷，水浴鍋60 ℃加熱。萃取時(shí)間為1 h，萃取結(jié)束后將二氯甲烷溶液過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，獲取砂仁揮發(fā)油樣品。

1.4 儀器條件

1.4.1 一維氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm, 0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技公司)，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比50∶1，進(jìn)樣體積0.5 μL，程序升溫方式：起始溫度50 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持1 min。

質(zhì)譜由四極桿串聯(lián)高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜構(gòu)成，離子源電壓為標(biāo)準(zhǔn)電壓70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，采集速度為 5 amu/s，采集質(zhì)量范圍為45～450 amu，全掃描，檢索譜庫(kù)為NIST 17。

1.4.2 全二維氣相色譜-質(zhì)譜條件

柱系統(tǒng)由兩條色譜柱組成，第一根色譜柱同1.3.1的一維氣相色譜系統(tǒng)一致，第二根色譜柱為DB-17(1.2 m×0.18 mm, 0.18 μm，美國(guó)安捷倫科技公司)，兩根色譜柱通過(guò)固態(tài)熱調(diào)制器串聯(lián)連接，調(diào)制周期為4 s，質(zhì)譜采集速率為50 amu/s，其他色譜及質(zhì)譜參數(shù)同一維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)。

1.5 定性分析方法

一維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-QTOF/MS)檢測(cè)數(shù)據(jù)采用安捷倫MassHunter B.08版工作站的“未知物分析”軟件分析，全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC×GC-QTOF/MS)檢測(cè)數(shù)據(jù)采用雪景科技的Canvas全二維色譜處理軟件分析，分析結(jié)果均與NIST 17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行匹配，并結(jié)合保留指數(shù)和高分辨質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)來(lái)進(jìn)行輔助定性分析，同時(shí)采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 一維與二維氣相色譜分離比較

將同時(shí)蒸餾萃取法得到的砂仁揮發(fā)油樣品稀釋后分別進(jìn)行一維和全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法分析，一維選取匹配度不低于80(最高為100)的化合物信息，全二維選取正、反向匹配度均大于800(最高為1000)的化合物信息，同時(shí)使用保留指數(shù)和精確質(zhì)量數(shù)比對(duì)作為輔助定性手段，進(jìn)一步確保定性結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。其中保留指數(shù)以計(jì)算值和文獻(xiàn)值誤差在±5%以?xún)?nèi)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定最佳匹配化合物[12]，對(duì)含有分子離子碎片信息的最佳匹配化合物進(jìn)行精確分子量的實(shí)測(cè)值和理論值比較，以相對(duì)偏差不超過(guò)5 ppm為判定信息[13-14]，確定出最終的定性結(jié)果?；谝陨吓卸ǚ椒?，一維系統(tǒng)一共鑒定出了36種化合物，而全二維系統(tǒng)鑒定出了83種化合物，且后者包含了前者的全部化合物信息，由此說(shuō)明該方法下全二維的檢測(cè)結(jié)果更加全面而準(zhǔn)確，具有很好的替代性。具體檢測(cè)成分見(jiàn)表1。

表1 砂仁揮發(fā)油的一維和全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)成分表Table 1 The detection of volatile oils of Amomum villosum by one-dimensional and full two-dimensional gas ghromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry

續(xù) 表

全二維系統(tǒng)比一維系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果更全面主要原因在于前者對(duì)樣品具有更好的分離度和靈敏度。由圖1可知，在22.65～23.00 min，一維系統(tǒng)上僅檢測(cè)到峰1(桃金娘烯醛)，分子式C10H14O，而在全二維系統(tǒng)上除了檢測(cè)到峰1a(桃金娘烯醛)外，還可以檢測(cè)到峰1b(桃金娘烯醇)，分子式C10H16O，并且檢測(cè)到的分子離子碎片的精確質(zhì)量數(shù)分別為150.1041和152.1196，也驗(yàn)證了它們是兩種不同的化合物，此例可以說(shuō)明全二維系統(tǒng)有利于解決色譜峰共流出的問(wèn)題。另外，在35.80～41.00 min這段時(shí)間，全二維系統(tǒng)檢測(cè)到了τ-杜松醇等12種化合物，其中以醇類(lèi)和酚類(lèi)化合物為主，而一維系統(tǒng)卻無(wú)法檢測(cè)到，由此說(shuō)明前者在檢測(cè)靈敏度，尤其是針對(duì)醇類(lèi)和酚類(lèi)化合物的檢測(cè)上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖1 砂仁揮發(fā)油的一維和全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分離效果圖Fig.1 The separation effect chart of volatile oils of Amomum villosum by one-dimensional and full two-dimensional gas ghromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry

2.2 不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油的分析

鑒于全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)更好的分離度和靈敏度，選取了道地產(chǎn)區(qū)廣東陽(yáng)春和主產(chǎn)區(qū)廣西南寧、云南文山三地的砂仁樣品進(jìn)行了揮發(fā)油的提取和分析，每個(gè)產(chǎn)地的樣品提取2次，基于2.1所述的判定方法，一共準(zhǔn)確鑒定出了107種化合物，其中廣東、廣西和云南的樣品分別鑒定到了79，64，64種化合物，詳細(xì)化合物名稱(chēng)和相對(duì)含量見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 2 The analysis results of chemical components of volatile oils of Amomum villosum from different producing areas

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

乙酸龍腦酯作為砂仁揮發(fā)油含量最高，且最主要的藥效成分，其含量在廣東、廣西和云南樣品中所占比例分別為17.54%、19.50%和15.20%，差異并不明顯，說(shuō)明這3個(gè)產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油的藥效差別并不大。除此之外，樟腦、雙環(huán)吉馬烯、2-茨醇、α-蒎烯、α-松油醇、右旋大根香葉烯和β-檀香烯為共有成分中含量較高的，以上8種主成分總含量占比分別為41.71%、42.44%和36.01%，云南樣品略低，但云南樣品中β-檀香烯的含量明顯較其他兩地高，可以作為其品質(zhì)特征成分之一。另外，α-檀香烯、β-杜松烯和β-石竹烯是3個(gè)產(chǎn)地中多數(shù)共有的含量較高的成分。其中α-檀香烯和β-杜松烯在廣西樣品中未檢出，β-石竹烯在廣東樣品中未檢出，而在云南樣品中能夠檢測(cè)到，但較廣西樣品中含量低。因此，多數(shù)共有化合物及含量差異，可為不同產(chǎn)地砂仁的品質(zhì)特征提供參考。綜上，不同地方砂仁共有成分含量差異見(jiàn)圖2。

圖2 3種不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油中主成分的分布Fig.2 The distribution of principal components in volatile oils of Amomum villosum from three different producing areas

將廣東、廣西和云南的砂仁揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分類(lèi)，包含烯烴、醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)和羧酸類(lèi)等多種成分，各類(lèi)化合物所占含量和數(shù)量見(jiàn)圖3。

圖3 3種不同產(chǎn)地砂仁揮發(fā)油成分種類(lèi)的相對(duì)含量和數(shù)量Fig.3 The relative content and quantity of components'types in volatile oils of Amomum villosum from three different producing areas

由圖3可知，3個(gè)產(chǎn)地的砂仁揮發(fā)油主要成分為醇類(lèi)、烯烴、酯類(lèi)和酮類(lèi)化合物，但各類(lèi)化合物含量差異并不大。在各類(lèi)化合物的數(shù)量上，廣東樣品的揮發(fā)油所含醇類(lèi)和酚類(lèi)化合物數(shù)量較其他兩地多，尤其是酚類(lèi)化合物，廣東樣品有7種，而廣西和云南樣品分別為1種和2種。我們知道酚類(lèi)化合物一般都具有特殊的芳香氣味，這或許能解釋廣東作為道地產(chǎn)區(qū)的砂仁氣味具有明顯特征的原因[15]。

3 結(jié)論

全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)適合于復(fù)雜天然產(chǎn)物的分離鑒定，本實(shí)驗(yàn)將其用于砂仁揮發(fā)油的分析，并將其與普通一維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行比對(duì)，分別鑒定到了83種和36種化合物，充分表明了全二維系統(tǒng)在峰容量和分析靈敏度上的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其是在醇類(lèi)和酚類(lèi)化合物的分析上，優(yōu)勢(shì)較為明顯。此外，本文對(duì)來(lái)自廣東陽(yáng)春、廣西南寧和云南文山的砂仁揮發(fā)油樣品共檢測(cè)到了107種化合物，其中分析到的廣東樣品揮發(fā)油成分有79種，其他兩地均為64種。通過(guò)對(duì)主要成分的比較，發(fā)現(xiàn)廣西樣品的β-石竹烯含量較高，云南樣品的β-檀香烯含量較高，而廣東樣品的α-檀香烯和β-杜松烯含量較高。另外，從化合物類(lèi)型的數(shù)量上看，廣東樣品的醇類(lèi)和酚類(lèi)含量均較高。因此，以上特征成分可作為不同產(chǎn)地砂仁品質(zhì)特征的參考標(biāo)志。