大豆糖蜜制備調(diào)味液基料的技術(shù)研究

李 琰

(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

醇法生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白過程中，乙醇溶解了大部分可溶物質(zhì)，再經(jīng)多次濃縮處理后，得到副產(chǎn)物大豆糖蜜，故大豆糖蜜是大豆?jié)饪s蛋白產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品[1]。大豆糖蜜全球年產(chǎn)量達(dá)10萬(wàn)噸[2]，由于其性狀粘稠，深加工困難，故常用作廉價(jià)飼料，易造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[3]。大豆糖蜜中的主要成分糖類占比大約為59%～62%，同時(shí)含有蛋白質(zhì)、異黃酮、皂甙等，是很好的發(fā)酵底物，可用于多種產(chǎn)品的開發(fā)[4]。

目前，大豆糖蜜的研究呈多元化[5-6]，大豆糖蜜可用作微生物發(fā)酵的豐富碳源，用以產(chǎn)生乳酸、細(xì)菌纖維素、檸檬酸、生物燃料乙醇和丁醇等[7-10]。

大豆糖蜜的主要成分中，糖類占比最高，前期崔元峰等[11]、李振林[12]對(duì)大豆糖蜜發(fā)酵制備酒精開展了研究，但制作酒精造成大豆糖蜜中的低聚糖及功能性成分流失，本研究用大豆糖蜜添加活性干酵母釀造酒，生產(chǎn)出一種顏色鮮艷、口感宜人并具有保健功能的調(diào)味液基料，可作為調(diào)味液的酒香成分來源，并可提供調(diào)味醬的風(fēng)味物質(zhì)，提高調(diào)味醬的防腐性能，抑制調(diào)味醬漲袋產(chǎn)酸等現(xiàn)象，并可進(jìn)一步通過好氧發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽食醋，具有一定的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

對(duì)發(fā)酵型的調(diào)味液基料而言，菌種添加量、營(yíng)養(yǎng)鹽添加量及發(fā)酵過程中溫度和pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果有重要意義，本文以大豆糖蜜為材料，經(jīng)預(yù)處理，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察酵母添加量、營(yíng)養(yǎng)鹽添加量、溫度和pH，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

大豆糖蜜：黑龍江雙河松嫩大豆生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 儀器

Waters 600高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；HWS-250B生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；WZS10手提式折光糖度計(jì)、PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JA31001電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.1.3 試劑

W-ADY葡萄酒高活性酵母：安琪酵母有限公司；磷酸氫二氨(分析純)、氫氧化鈉(分析純)：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)、蔗糖(標(biāo)準(zhǔn)品)、水蘇糖(標(biāo)準(zhǔn)品)、棉子糖(標(biāo)準(zhǔn)品)：北京譜析公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆糖蜜的預(yù)處理方法

因?yàn)槠浜须s質(zhì)，導(dǎo)致微生物的污染比較嚴(yán)重，所以，在糖蜜稀釋的同時(shí)，需要進(jìn)行滅菌、靜置、澄清等預(yù)處理，包括對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，自然冷卻后靜置澄清。

1.2.1.1 稀釋

用量筒量取800 mL糖蜜置于三角燒瓶中，再加入800 mL無(wú)菌水，用玻璃棒混合至均勻，做好棉塞，包上報(bào)紙，待用。

1.2.1.2 加熱滅菌

加熱滅菌不僅可以去除待發(fā)酵液中的野生菌種，也對(duì)接下來的澄清有幫助。放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃，30 min。可在滅菌前對(duì)糖液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，可有助于滅菌。

1.2.1.3 澄清

滅菌后的液體自然冷卻后會(huì)出現(xiàn)明顯的分層，其較為澄清的上清液即可進(jìn)行發(fā)酵(在未使用之前，盡量不要打開牛皮紙，避免染菌)。

1.2.2 大豆糖蜜釀造工藝流程

測(cè)量預(yù)處理后大豆糖蜜上清液的糖度；

確定糖蜜與水的稀釋比例，調(diào)節(jié)折光儀初始糖度為20 °Brix；

用30%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH；

在121 ℃下滅菌30 min；

靜置冷卻后，添加磷酸氫二銨；

加入適當(dāng)濃度的活性干酵母，混合均勻后發(fā)酵；

放入生化箱中恒溫培養(yǎng)72 h；

每隔12 h測(cè)量發(fā)酵液的糖度，并蒸餾測(cè)量酒度，監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程；

選取發(fā)酵72 h后的樣品進(jìn)行色譜分析。

1.2.3 酒度的測(cè)定

發(fā)酵液開始發(fā)酵后，每隔12 h取出100 mL的樣品，再加入100 mL的蒸餾水，混合均勻后進(jìn)行蒸餾，取100 mL的液體置于量筒中，用酒度計(jì)測(cè)酒度，再根據(jù)溫度對(duì)照酒精計(jì)手冊(cè)得出酒度值。

1.2.4 還原糖的測(cè)定

用移液管取2 mL的發(fā)酵液，0號(hào)管中加入2 mL的蒸餾水，再分別在每個(gè)試管中加入1.5 mL的DNS溶液，放入沸水浴煮沸加熱5 min，拿出后立即冷卻，再加入21.5 mL的蒸餾水稀釋，然后測(cè)量吸光值，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出糖度值。

1.2.5 低聚糖的測(cè)定

樣品前處理：將用水1∶1稀釋過的樣品與80%乙醇溶液等量混合，在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液過0.22 μL針頭過濾器，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

色譜條件：色譜柱：Cosmosil sugar-D column(4.5 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；流動(dòng)相：ACN∶水為75∶25；進(jìn)樣量：20 μL，時(shí)間：45 min。

1.2.6 感官評(píng)價(jià)

按 GB/T 15038-2005對(duì)釀造完成的樣品酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)價(jià)表Table 1 The sensory evaluation criteria table

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用1.2.1的方法對(duì)大豆糖蜜進(jìn)行預(yù)處理后，調(diào)配糖度至20 °Brix，采用1.2.4和1.2.5的測(cè)定方法，測(cè)得總糖為189.94 g/L，其中蔗糖為104.83 g/L，棉子糖為11.55 g/L，水蘇糖為62.48 g/L。參考前人研究的結(jié)果，本文選擇發(fā)酵液初始糖度為20 °Brix，菌種采用葡萄酒釀酒干酵母，發(fā)酵時(shí)間為72 h，在此前提下，考察酵母添加量、營(yíng)養(yǎng)鹽添加量、發(fā)酵pH和溫度對(duì)發(fā)酵后酒精度的影響。

2.1.1 酵母添加量對(duì)酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至4.5，加入0.3%的磷酸二氫銨，發(fā)酵溫度為26 ℃，分別加入2%、3%、4%、5%、6%的酵母，發(fā)酵72 h后測(cè)定酒度值，結(jié)果見圖1。

圖1 酵母添加量對(duì)酒精度的影響Fig.1 Effect of yeast additive amount on alcohol content

由圖1可知，酒精度隨著酵母添加量的增加急劇上升，當(dāng)酵母添加量達(dá)到4%以后，增速放緩，這是由于酵母添加量達(dá)到一定程度后，發(fā)酵速度加快，酵母的生長(zhǎng)也消耗了部分還原糖，酒精度的上升速度變緩，故4%是比較合適的酵母添加量。

2.1.2 營(yíng)養(yǎng)鹽添加量對(duì)酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，酵母添加量4%，調(diào)節(jié)pH至4.5，發(fā)酵溫度為26 ℃，分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的營(yíng)養(yǎng)鹽，發(fā)酵72 h后測(cè)定酒度值，結(jié)果見圖2。

圖2 營(yíng)養(yǎng)鹽添加量對(duì)酒精度的影響Fig.2 Effect of nutritive salt additive amount on alcohol content

添加適量營(yíng)養(yǎng)鹽可以改善酵母菌的生長(zhǎng)環(huán)境，為酵母的生長(zhǎng)提供氮源，從而提高酵母的繁殖速度，增強(qiáng)酵母的活性，這對(duì)提高發(fā)酵產(chǎn)物的酒精濃度有明顯的作用，當(dāng)添加量超過0.3%時(shí)，增加幅度變小，故0.3%是比較適合的營(yíng)養(yǎng)鹽添加量。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，酵母添加量4%，調(diào)節(jié)pH至4.5，營(yíng)養(yǎng)鹽添加量0.3%，發(fā)酵溫度分別為22，24，26，28，30 ℃，發(fā)酵72 h后測(cè)定酒度值，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由圖3可知，酵母受溫度的影響非常明顯，當(dāng)溫度處在較低水平時(shí)，酵母生長(zhǎng)受到制約，酒精轉(zhuǎn)化率低，溫度過高使得酵母繁殖過快，菌種過快老化，后期酶活不足，影響酒精轉(zhuǎn)化率，在26 ℃時(shí)酒精度最高。

2.1.4 pH對(duì)酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，酵母添加量4%，營(yíng)養(yǎng)鹽添加量0.3%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵液pH分別調(diào)至3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，發(fā)酵72 h后測(cè)定酒度值，結(jié)果見圖4。

圖4 pH對(duì)酒精度的影響Fig.4 Effect of pH on alcohol content

由圖4可知，pH對(duì)酵母活性影響非常大，該酵母最適pH為4.5左右，此時(shí)酒精度最高。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从掣饕蛩貙?duì)發(fā)酵的影響規(guī)律，這些規(guī)律可以幫助確定正交實(shí)驗(yàn)的零水平，本實(shí)驗(yàn)不考慮交互作用，故可設(shè)計(jì) L9(34)正交實(shí)驗(yàn)來確定大豆糖蜜制備果酒的最佳工藝條件，考察指標(biāo)為發(fā)酵完成后酒精度和感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)，因素水平編碼表見表2，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果Table 3 The experimental arrangement and results

由表2和表3可知，對(duì)于酒精度，4個(gè)因素對(duì)酒精度的影響次序是酵母添加量>發(fā)酵溫度>營(yíng)養(yǎng)鹽添加量>pH，最優(yōu)組合為A2B3C2D2(酵母添加量4%，營(yíng)養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5)；對(duì)于感官評(píng)價(jià)而言，4個(gè)因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響次序是酵母添加量>營(yíng)養(yǎng)鹽添加量>發(fā)酵溫度>pH，最優(yōu)組合為A2B3C2D2(酵母添加量4%，營(yíng)養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5)。兩個(gè)目標(biāo)值的最優(yōu)組合是相同的，所有大豆糖蜜的發(fā)酵工藝條件可以確定為酵母添加量4%，營(yíng)養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按正交實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)組合，在酵母添加量4%，營(yíng)養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5的條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)發(fā)酵品的酒精度和糖度，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of verification experiment

由表4可知，正交實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)組合是可信的，其發(fā)酵產(chǎn)物的酒精度達(dá)6.3%，感官評(píng)價(jià)分值為79，均是較優(yōu)水平。發(fā)酵后，蔗糖含量為9.37 g/L，說明發(fā)酵過程利用了91.1%的蔗糖，發(fā)酵效果較好，水蘇糖和棉子糖并未參與到發(fā)酵過程中，含量變化不大，略有損耗，水蘇糖的保留率為88.3%，棉子糖的保留率為92.7%。

3 結(jié)論

本文采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)調(diào)味液基料的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)：酵母添加量為4%，營(yíng)養(yǎng)鹽添加量為0.4%，發(fā)酵溫度為26 ℃，pH為4.5。在此條件下獲得的調(diào)味液基料酒精度為6.3%，感官評(píng)價(jià)分值為79分，功能性低聚糖保留率高，水蘇糖的保留率為88.3%，棉子糖的保留率為92.7%。