草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌機理研究

唐志凌，趙明明，陳靖潼，高璐瑤，陳文學(xué)，李遠頌

(1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，?？?570228；2.海南大學(xué) 研究生處，?？?570228)

草果(Amomumtsao-ko)為姜科豆蔻屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國的云南、廣西、貴州等地[1]。草果具有特殊辛香味，并能去除腥味，現(xiàn)今多將草果用于烹調(diào)肉類食品，是日常生活中必備的調(diào)味香料，被人們譽為食品調(diào)味中的“五香之一”[2]。研究表明，在草果中檢測出痕量硒，適當(dāng)補硒有益人體健康，因此經(jīng)常食用草果對人體有一定的營養(yǎng)保健功效[3]。同時草果也是我國一種傳統(tǒng)的中藥材，可改善瘧疾、咳嗽、積食等癥狀[4]。草果揮發(fā)油有較好的抗氧化性，對于清除羥自由基和超氧陰離子自由基有著十分顯著的效果[5-6]。此外，草果提取物還具有抑菌效果，Cui Qi等[7]研究表明草果提取物具有較強的廣譜抗菌活性；謝小梅等[8]通過對草果揮發(fā)油的深入研究發(fā)現(xiàn)其對產(chǎn)黃青霉、黑曲霉等真菌具有良好的殺菌效果。

由于微生物活動和氧化等作用，肉制品很容易腐敗變質(zhì)。目前，為了防止肉制品的腐敗變質(zhì)，保持其新鮮度，常常在其中添加化學(xué)防腐劑，但長時間研究表明，有些化學(xué)防腐劑具有誘癌性、致畸性、低毒性以及某些潛在的危害[9]。天然防腐劑因安全、高效等優(yōu)點在食品行業(yè)受到廣泛關(guān)注。從植物中提取有效成分抑菌防腐已成為研究的熱點，而香辛料是其主要來源之一。食源大腸桿菌(Escherichiacoli)與沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)是食品安全領(lǐng)域中最常見的致病菌[10]，草果多用于肉制品的調(diào)味。本研究在對草果抑菌物質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化并初步探討其抑菌活性的基礎(chǔ)上[11]，進一步探索草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌機理，為草果提取物應(yīng)用于肉制品的防腐保鮮提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)：海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、丙酮：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124N型電子天平；SPX-288智能型生化培養(yǎng)箱；XB-HP型中藥粉碎機；SHA-2型水浴全溫振蕩器；GGT7型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；GI54DS型高壓滅菌鍋；SW-CJ-1FD 型無菌超凈工作臺；Christ Alphal型細胞冷凍干燥機；S-3000型掃描式電子顯微鏡；TU1810 型紫外可見分光光度計；CR22N型落地式高速冷凍離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 草果抑菌活性物質(zhì)的提取

草果的產(chǎn)地和提取方法使得提取物的成分組成產(chǎn)生差異[12]。本實驗參考彭美芳等[13]的提取方法，將草果粉浸泡、超聲后得到草果粗提物，然后采用乙酸乙酯萃取法，得到抑菌效果最佳的草果乙酸乙酯萃取物。

1.3.2 菌種活化

將大腸桿菌、沙門氏菌在培養(yǎng)基中傳代活化后，培養(yǎng)18～24 h，采用麥氏比濁法調(diào)整菌液濃度為106～107CFU/mL待用[14]。

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

采用肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度。抑制液的配制采用二倍梯度稀釋法[15]，制成終濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125 mg/mL的含藥培養(yǎng)基。將供試菌接種至含藥培養(yǎng)基上，同時設(shè)置空白組。倒置培養(yǎng)24 h后，觀察。以完全不長菌的最小稀釋濃度確定為草果萃取物對大腸桿菌、沙門氏菌作用的MIC。參考潘旭遲等[16]的方法，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，以完全不長菌的最小稀釋濃度確定為草果萃取物對大腸桿菌、沙門氏菌作用的MBC。

1.3.4 生長曲線的測定

采用紫外分光光度法測定大腸桿菌和沙門氏菌的生長曲線[17]。將供試菌接種至液體培養(yǎng)基中，加入抑菌物質(zhì)，調(diào)至各自最小抑菌濃度，同時設(shè)置空白組和陰性對照組。恒溫培養(yǎng)24 h，每2 h取樣，測定樣品在600 nm下的OD值。以時間和OD值為橫、縱坐標繪制對應(yīng)的生長曲線。

1.3.5 細胞形態(tài)的觀察

采用掃描電鏡法觀察兩種細胞微觀形態(tài)的變化。在培養(yǎng)至各自對數(shù)期的菌懸液中加入終濃度為1×MIC的草果提取物, 并設(shè)置空白組和陰性對照組。放置于最適溫度，在180 r/min搖床中培養(yǎng), 分別取培養(yǎng)至4，8 h的菌懸液, 低溫離心10 min后，各自收集菌體。再依次使用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.2)和乙醇溶液梯度洗脫3次。最后通過細胞凍干機低溫凍干后取樣鍍金, 在電子顯微鏡上放大8000倍觀察細胞微觀形態(tài)。

1.3.6 堿性磷酸酶(AKP)的測定

將供試菌分別接種至液體培養(yǎng)基中，加入草果提取物，調(diào)至各自最小抑菌濃度，同時設(shè)置空白組和陰性對照組。在水浴振蕩器培養(yǎng)8 h，每隔2 h取樣，按照AKP試劑盒的要求測定不同樣品在520 nm波長下的OD值，并計算出對應(yīng)的AKP活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC和MBC

由表1可知，草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌均有較好的抑菌效果，且抑菌效果隨草果提取物濃度的上升而增強。當(dāng)草果提取物濃度為0.625 mg/mL時，大腸桿菌難以生長；當(dāng)草果提取物濃度為1.25 mg/mL時，沙門氏菌無法生長，表明草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，且丙酮對大腸桿菌和沙門氏菌的生長在此次實驗條件下影響較小。另外，草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的最小殺菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，與其各自最小抑菌濃度相同。說明草果提取物對細菌的抑制作用較為明顯，且這種抑制作用在短時間內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

表1 大腸桿菌和沙門氏菌的生長情況Table 1 The growth situations of Escherichia coli and Salmonella typhimurium

2.2 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌生長的影響

草果提取物分別作用大腸桿菌和沙門氏菌24 h，研究其對細菌生長的影響，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 草果提取物對大腸桿菌生長的影響Fig.1 Effects of Amomum tsao-ko extracts on the growth of Escherichia coli

由圖1可知，添加水和丙酮組的細菌生長呈現(xiàn)出明顯的S形曲線，并OD值分別在14 h和24 h時達到1.287和1.118。丙酮組細菌生長較慢于空白組，但對于細菌最終生長結(jié)果并無顯著影響，因此可說明在本實驗中丙酮對于大腸桿菌的影響較小。添加終濃度為1×MIC草果提取物的實驗組，在4～16 h內(nèi)生長較為緩慢，OD值無明顯上升；在16～24 h期間OD值略有上浮，但幅度較小，隨后趨向平穩(wěn)狀態(tài)，最終OD值僅達到0.408，并顯著低于對照組。實驗結(jié)果表明，加入終濃度為1×MIC的草果提取物能夠有效抑制大腸桿菌的生長。

由圖2可知，添加水和丙酮組的沙門氏菌生長狀態(tài)同大腸桿菌相似，說明在本實驗中丙酮對沙門氏菌的影響較小。相比于大腸桿菌，沙門氏菌添加終濃度為1×MIC草果提取物的實驗組在數(shù)值上較高，在6～18 h內(nèi)生長較為緩慢；在18～24 h期間OD值略有上升，達到0.686。實驗結(jié)果說明，終濃度為1×MIC的草果提取物同樣對沙門氏菌的生長有著良好的抑制效果，但對大腸桿菌的抑菌效果更好。

圖2 草果提取物對沙門氏菌生長的影響Fig.2 Effects of Amomum tsao-ko extracts on the growth of Salmonella typhimurium

2.3 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌細胞形態(tài)的影響

水、丙酮和草果提取物分別作用大腸桿菌、沙門氏菌4 h和8 h后，觀察電子顯微鏡下細胞形態(tài)的變化，掃描電鏡圖見圖3(大腸桿菌)和圖4(沙門氏菌)。

圖3 大腸桿菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.3 The scanning electron microscopy of Escherichia coli注：A1為空白組(4 h)；A2為空白組(8 h)；B1為丙酮組(4 h)；B2為丙酮組(8 h)；C1為實驗組(4 h)；C2為實驗組(8 h)。

圖4 沙門氏菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.4 The scanning electron microscopy of Salmonella typhimurium注：D1為空白組(4 h)；D2為空白組(8 h)；E1為丙酮組(4 h)；E2為丙酮組(8 h)；F1為實驗組(4 h)；F2為實驗組(8 h)。

由圖3和圖4可知，掃描電鏡下，空白組(A1、A2；D1、D2)的大腸桿菌和沙門氏菌細胞形態(tài)完整，菌體飽滿，表面較為光滑，細胞無明顯破損且無內(nèi)容物外泄現(xiàn)象。丙酮組(B1、B2；E1、E2)的大腸桿菌和沙門氏菌培養(yǎng)4 h后，細菌形態(tài)完整，細胞邊界較為清晰；培養(yǎng)8 h后，大腸桿菌出現(xiàn)局部黏連，但多數(shù)細胞仍能保持完整形態(tài)，無明顯破損，表面光滑；而沙門氏菌經(jīng)丙酮組處理8 h與處理4 h無顯著差異，細菌形態(tài)并未產(chǎn)生異常變化。實驗組(C1、C2)的大腸桿菌在草果提取物處理4 h后，細菌形態(tài)與空白組和丙酮組無顯著差異；而在處理8 h后，細菌細胞出現(xiàn)大面積黏連和破損，菌體收縮，表面粗糙，細胞邊界模糊，部分細胞呈現(xiàn)嚴重破裂，造成細胞內(nèi)容物外泄，而較為黏稠的細胞內(nèi)容物使得細胞的黏連和重疊現(xiàn)象嚴重。實驗組(F1、F2)的沙門氏菌在經(jīng)草果提取物處理4 h后，細胞形態(tài)變化不明顯，絕大多數(shù)細胞仍呈現(xiàn)出完整且光滑的細菌表面；在處理8 h后，沙門氏菌與大腸桿菌表現(xiàn)相似，也出現(xiàn)菌體黏連和斷裂現(xiàn)象，細菌菌體呈現(xiàn)不同程度的扭曲，表面粗糙，細胞邊界不明顯。部分細菌破裂成塊狀，外泄的細胞內(nèi)容物導(dǎo)致其與其他破裂的細菌黏合在一起，呈現(xiàn)大面積的細菌體堆疊。由大腸桿菌和沙門氏菌所得結(jié)果可知，1×MIC的草果提取物在處理大腸桿菌和沙門氏菌8 h后，能夠顯著破壞這兩種細菌細胞的正常形態(tài)，導(dǎo)致細胞受到破壞且使得細胞內(nèi)容物外泄。

2.4 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌AKP活力的影響

水、丙酮和草果提取物連續(xù)作用大腸桿菌8 h，檢測胞外AKP含量，結(jié)果見圖5。

圖5 大腸桿菌的胞外AKP含量Fig.5 The extracellular AKP content of Escherichia coli

AKP酶存在于細胞壁與細胞膜之間，正常情況下，當(dāng)細菌的細胞壁完整未受到損傷時，AKP酶不會泄露到環(huán)境中去。因此，檢測細菌生長環(huán)境的AKP酶含量可以間接表明細胞壁是否受到損傷[18]。由圖5可知，空白組和丙酮組的胞外AKP酶含量隨著時間的推移增長緩慢。而添加了1×MIC草果提取物的大腸桿菌實驗組，其胞外AKP酶的含量隨時間的增長呈明顯上升趨勢，且在各時間點遠大于對照組的AKP含量。在6～8 h時，胞外AKP含量迅速增加，說明此時細胞壁已經(jīng)受到了損傷，細胞壁的完整度被破壞。結(jié)合大腸桿菌掃描電鏡圖分析，草果提取物對大腸桿菌細胞壁通透性的改變主要從6～8 h開始?？赡苁谴蠓肿游镔|(zhì)穿過細胞壁，使得細胞壁形成孔洞，最終演變成塌陷，細菌細胞逐漸萎縮[19]。

水、丙酮和草果提取物連續(xù)作用沙門氏菌8 h，檢測胞外AKP含量，結(jié)果見圖6。

圖6 沙門氏菌的胞外AKP含量Fig.6 The extracellular AKP content of Salmonella typhimurium

由圖6同樣可以明顯觀察到添加了草果提取物的實驗組在6～8 h內(nèi)上升幅度最大。但與大腸桿菌整體呈現(xiàn)上升趨勢不同的是，沙門氏菌在實驗的前4 h內(nèi)，無論是實驗組、空白組還是丙酮組，3組的胞外AKP酶含量基本保持不變。而從4 h開始，添加了草果提取物的實驗組，其胞外AKP酶含量開始顯著升高。說明終濃度為1×MIC的草果提取物對沙門氏菌細胞壁的破壞作用主要發(fā)生在4 h之后，且效果顯著。

3 結(jié)論與討論

本實驗從細胞層面上進行研究，初步探究了草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌兩種常見致病菌的抑菌機理。結(jié)果表明，草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制作用，其最小抑菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，且最小殺菌濃度也均為0.625，1.25 mg/mL。草果提取物能夠使大腸桿菌和沙門氏菌的細胞形態(tài)遭到破壞，細胞壁的通透性增加，從而抑制細菌的生長繁殖。

草果提取物既可加強肉制品的風(fēng)味，又有顯著的抑菌效果，在未來開發(fā)天然防腐劑等方面具有巨大的潛力。本實驗已初步探索了草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌這兩種食品中常見致病菌的抑菌機理，表明草果提取物在食品加工防腐等方面應(yīng)用價值較大。當(dāng)前，對草果提取物抑菌機制的研究尚不充分，未來期望進一步探明草果提取物對不同致病菌的抑菌活性和抑菌機理，并擴大草果提取物在食品貯藏和加工領(lǐng)域的使用范圍。