共同性外斜視眼外肌MYH13水平與病理形態(tài)學(xué)及預(yù)后的關(guān)系研究

楊 英，王 煒，馬芳芳

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院北京路醫(yī)療區(qū)眼科三病區(qū)，烏魯木齊 830013)

斜視是眼科常見疾病之一，也是引發(fā)雙眼視覺功能障礙最常見原因，其發(fā)病率高，為3%～5%，嚴(yán)重影響患者生活與工作[1]。共同性斜視是斜視最常見類型，其斜視角度不因注視方向、注視眼別的改變而變化，其發(fā)病率約占斜視總發(fā)病率的80%[2]。共同性斜視臨床常用治療方法有保守治療與手術(shù)治療，而手術(shù)治療是其第一治療方案，可達(dá)到功能性治愈目的[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，斜視眼外肌中一些基因表達(dá)變化與肌纖維形態(tài)、數(shù)量等相關(guān)，肌球蛋白重鏈13基因(myosin heavy chain gene 13，MYH13)在眼外肌中表達(dá)，在眼外肌高速掃視收縮中發(fā)揮重要作用[4]。但關(guān)于MYH13在共同性外斜視患者眼外肌中表達(dá)的研究較少，因此，本研究初步探討MYH13與共同性外斜視患者眼外肌病理形態(tài)學(xué)及預(yù)后的關(guān)系，旨在為其治療及分子機(jī)制研究提供參考資料，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2018年10月本院眼科收治的86例行斜視矯正術(shù)治療的共同性外斜視患者作為研究對象(斜視組)，依據(jù)眼外肌(內(nèi)直肌)中MYH13 mRNA水平中位數(shù)分為MYH13高表達(dá)組和MYH13低表達(dá)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合共同性外斜視診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)雙眼球各方向運(yùn)動不受限；(3)第一、二斜視角相等；(4)年齡大于1歲；(5)患者及家屬知情，簽署知情同意書；(4)經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)智力發(fā)育障礙，無法配合檢查者；(2)有眼部手術(shù)史者；(3)伴眼部器質(zhì)性病變者；(4)高度近視、遠(yuǎn)視、弱視、屈光參差大于2.00 D及散光者；(5)垂直斜視者；(6)合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；(7)全身器質(zhì)性疾病者；(8)術(shù)后隨訪資料不完整者。共同性外斜視組男39例，女47例，年齡3～28歲，平均(11.89±3.42)歲；發(fā)病年齡1.3～7.8歲，平均(3.50±1.10)歲；病程3.2～11.6年，平均(5.46±1.13)年，外斜視度數(shù)45°～90°，平均(67.50±8.50)°。另選取28例因外傷所致需眼球摘除患者(無斜視)的眼外肌(內(nèi)直肌)作為對照組，其中男13例，女15例；年齡7～32歲，平均(13.18±3.13)歲；19例為眼球破裂，9例為眼球貫通傷。斜視組和對照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1眼外肌MYH13 mRNA表達(dá)檢測

采用實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測MYH13 mRNA表達(dá)，MYH13引物序列：上游為5′-TGA CCG CAG CAT CTC TAG GAA GAC G-3′，下游為5′-TTC CGG AGG TAG GGA GCT GCT TC-3′，內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游為5′-CCC GCT TCG CTC TCT GCT CC-3′，下游為5′-ACC AG G CGC CCA ATA CGA CC-3′。Trizol(美國Invitrogen公司)法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)合成cDNA，qRT-PCR試劑盒(日本TAKARA公司)配制反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算眼外肌MYH13 mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.2眼外肌MYH13蛋白水平檢測

提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白于10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加山羊抗MYH13(美國Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH，分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊、鼠抗兔二抗，ECL染色，膠片曝光，顯影，定影，計(jì)算MYH13蛋白表達(dá)水平。

1.2.3眼外肌病理形態(tài)學(xué)檢查

取眼外肌標(biāo)本，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作厚度3 μm眼外肌縱向切片，切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，酒精脫水，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，脫水、透明，封片；采用Olympusl X50倒置顯微鏡與PM304曝光控制系統(tǒng)觀察蘇木精-伊紅(HE)染色圖片及纖維照相，高倍鏡下隨機(jī)取5個視野，計(jì)算肌纖維數(shù)量，以平均數(shù)作為每例標(biāo)本肌纖維含量；采用Motic Med6.0圖片分析系統(tǒng)測量肌細(xì)胞的橫截面積，每張切片隨機(jī)測量20個肌細(xì)胞，取平均數(shù)。

1.2.4術(shù)后視覺三級功能檢測

采用同視機(jī)和Titmus立體圖檢測患者視覺3級功能，Ⅰ級同時視：采用猴子和熊貓圖片檢測有無同時視；Ⅱ級融合功能：在Ⅰ級基礎(chǔ)上用貓捉蝴蝶圖片檢測有無融合功能和融合范圍；Ⅲ級立體視：采用Titmus立體圖檢測近距離立體視情況，患者配戴偏振光鏡片，觀察不同級別圓環(huán)圖，記錄患者能否分辨出凹凸層次感的最小視差，≤60″者記為立體視功能正常，>60″者即無正常立體視。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 斜視組和對照組眼外肌MYH13 mRNA表達(dá)水平比較

斜視組眼外肌MYH13 mRNA相對表達(dá)水平為0.21±0.06，對照組為0.79±0.20，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。

M：Marker；a：對照組；b：斜視組。

圖2 qRT-PCR擴(kuò)增曲線圖

2.2 斜視組和對照組眼外肌MYH13蛋白水平比較

斜視組眼外肌MYH13蛋白水平為0.19±0.05，對照組為0.71±0.15，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 斜視組和對照組眼外肌MYH13蛋白表達(dá)

2.3 MYH13水平與共同性外斜視患者內(nèi)直肌病理形態(tài)的關(guān)系

MYH13高表達(dá)組內(nèi)直肌肌纖維平均橫截面積、肌纖維含量高于MYH13低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖4。

表1 斜視組內(nèi)直肌病理形態(tài)學(xué)比較

A：MYH13高表達(dá)組；B：MYH13低表達(dá)組；箭頭：肌纖維。

2.4 眼外肌MYH13水平與共同性外斜視患者術(shù)后斜視度數(shù)比較

術(shù)后6個月，MYH13高表達(dá)組斜視度數(shù)明顯低于MYH13低表達(dá)組[4(2，5)°vs.9(5，12)°],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 眼外肌MYH13水平與共同性外斜視患者術(shù)后視覺三級功能的關(guān)系

術(shù)后6個月，MYH13高表達(dá)組同時視、融合范圍、立體視高于MYH13低表達(dá)組(P<0.05)，兩組融合功能比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 斜視組術(shù)后視覺三級功能比較

3 討 論

共同性斜視以雙眼視覺不穩(wěn)定或未鞏固完善的兒童多見，6歲前多發(fā)，3歲內(nèi)為發(fā)病最集中年齡段，發(fā)病率為0.43%～1.70%，而12歲后發(fā)病率明顯降低[6]。在兒童時期，斜視可導(dǎo)致出現(xiàn)弱視、雙眼障礙等不可逆性的視覺中樞缺陷，成人期發(fā)病，則可導(dǎo)致復(fù)視發(fā)生[7]。斜視不僅導(dǎo)致患者雙眼視覺功能障礙，還影響患者面部美感，同時給患者造成嚴(yán)重心理創(chuàng)傷。因此，尋找該病發(fā)病機(jī)制及有效治療方法成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

眼外肌是控制眼球運(yùn)動的肌肉，由4條直肌與2條斜肌組成，有較強(qiáng)的收縮性與抗疲勞性，眼外肌的橫紋肌的低張力、高速度的收縮特性和眼外肌型肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)的表達(dá)密切相關(guān)，而眼外肌型MHC主要由MYH13編碼[8-9]。MYH13是人類17號染色體快速/發(fā)育MYH基因簇的重要成員之一，也是祖先骨骼肌與心肌肌球蛋白分化后在快速/發(fā)育簇中出現(xiàn)的第1個特異性肌球蛋白，具有物種間高度保守性，對眼外肌收縮特性有重要調(diào)控作用[10]。CHENG等[11]對黑暗飼養(yǎng)大鼠和單眼剝奪的猴子模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，眼外肌轉(zhuǎn)錄組發(fā)生改變，在斜視、弱視及先天性白內(nèi)障模型中MYH13表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致視覺運(yùn)動發(fā)育不良。田亮等[12]研究發(fā)現(xiàn)，共同性內(nèi)斜視患者眼外肌MYH13表達(dá)缺失，在其發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，共同性外斜視組眼外肌MYH13 mRNA水平與蛋白水平表達(dá)均低于對照組，與上述結(jié)果相似，提示共同性外斜視患者眼外肌MYH13低表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，共同性外斜視患者內(nèi)直肌肌纖維橫截面積明顯減小，肌纖維數(shù)量減少，排列紊亂及膠原纖維增生等病理性改變[13]。本研究結(jié)果顯示，MYH13高表達(dá)組內(nèi)直肌肌纖維平均橫截面積、肌纖維含量高于MYH13低表達(dá)組，提示MYH13高表達(dá)共同性外斜視患者內(nèi)直肌病變程度較輕，推測MYH13高表達(dá)可能有利于內(nèi)直肌中肌球蛋白維持在較高水平，有利于內(nèi)直肌結(jié)構(gòu)及功能維持[10]。

斜視是造成雙眼視覺功能異常最主要疾病之一，斜視和雙眼視覺功能之間的關(guān)系一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[14]。雙眼視覺是最完善的高級視覺功能，主要分為同時視、融合功能及立體視三級[15-16]。斜視不僅能對兒童時期雙眼視覺造成影響，同時也可破壞發(fā)育成熟的雙眼視覺，雙眼視覺功能的恢復(fù)及重建是斜視治療的首要目的，也是術(shù)后預(yù)后評定的重要指標(biāo)之一[17-18]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后6個月，MYH13高表達(dá)組共同性外斜視患者斜視度數(shù)低于MYH13低表達(dá)組，同時視、融合范圍、立體視均優(yōu)于MYH13低表達(dá)組，提示MYH13高表達(dá)共同性外斜視患者術(shù)后斜視矯正效果較優(yōu)，雙眼視覺功能恢復(fù)較好，推測MYH13高表達(dá)可能有助于共同性外斜視患者眼外肌結(jié)構(gòu)恢復(fù)，從而有利于其視覺功能恢復(fù)。

綜上所述，共同性外斜視患者眼外肌MYH13 mRNA與蛋白水平均低表達(dá)，MYH13高表達(dá)患者內(nèi)直肌肌纖維平均橫截面積較大、肌纖維含量較高，有利于術(shù)后斜視度數(shù)矯正和雙眼視覺功能恢復(fù)。然而本研究樣本量較少，為單中心研究，且未對不同年齡段患者進(jìn)行區(qū)分研究，可能會造成一定結(jié)果偏差，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量、豐富類型進(jìn)一步驗(yàn)證。