結(jié)核分枝桿菌對miR-21和TLR-4/NF-κB信號通路的影響研究*

麥 葉，林瑤瑤，劉海林，鐘有清

(1.海南省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，?？?570203；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?570102)

肺結(jié)核是1種主要由結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染引起的慢性消耗性傳染病，在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，其近年來發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。巨噬細(xì)胞可吞噬入侵的Mtb，并呈遞抗原，使機(jī)體獲得特異的抗結(jié)核免疫力，但Mtb是典型的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可通過多種機(jī)制逃避巨噬細(xì)胞的抗微生物作用，在巨噬細(xì)胞等宿主免疫細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖。研究顯示，機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)抑制Mtb生長，其中90%的病原體潛伏在感染病灶中，進(jìn)入休眠狀態(tài)。一旦免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常，休眠狀態(tài)的Mtb即進(jìn)入復(fù)蘇狀態(tài)，肺結(jié)核復(fù)發(fā)[2]。在肺結(jié)核致病及復(fù)發(fā)過程中，Mtb與巨噬細(xì)胞的相互影響發(fā)揮重要作用[3]。因此，研究其作用機(jī)制對于探討肺結(jié)核的臨床治療具有重要意義。Toll樣受體(TLR)是人呼吸道天然免疫中的關(guān)鍵受體，TLR4廣泛表達(dá)于氣道上皮，在呼吸道黏膜免疫中有重要作用，可能參與肺結(jié)核發(fā)生、發(fā)展[4]。有研究報道，微小RNA(miRNA/miR)可調(diào)節(jié)TLR信號通路[5]。本研究將Mtb感染RAW264.7和THP-1細(xì)胞后，對miR-21表達(dá)和TLR-4/核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響進(jìn)行分析，旨在研究Mtb與巨噬細(xì)胞的相互作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與細(xì)胞株

RAW264.7和THP-1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；強(qiáng)毒Mtb H37Rv及弱毒Mtb BCG(牛型結(jié)核桿菌減毒株，卡介苗)購自北京生物制品研究所。

1.1.2主要試劑與材料

DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)液、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自美國R&D公司；流式細(xì)胞儀、異硫氰酸熒光素(FITC)-膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物公司；本研究所使用ELISA試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；miR-21與內(nèi)參基因U6基因及TLR4、NF-κB和內(nèi)參基因β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞及Mtb培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞：復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)(5% CO2，37 ℃飽和濕度)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.1%胰蛋白酶消化懸浮，鋪于12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)(5×105個/mL)。THP-1細(xì)胞:復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)(5% CO2，37 ℃飽和濕度)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，調(diào)整濃度為5×105個/mL，利用佛波醇酯類多克隆刺激(PMA)誘導(dǎo)24 h，待細(xì)胞分化貼壁后，在12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。Mtb：將羅氏培養(yǎng)基上的H37Rv菌落分別刮下，接種于7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，液體可見明顯渾濁，且有白色顆粒，菌膜掛壁；BCG菌株接種于7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，可見液體稍許渾濁，且有黃色顆粒，菌膜掛壁。

1.2.2Mtb感染RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞模型建立

細(xì)胞濃度為5×105個/mL，Mtb濃度5×106個/mL，使Mtb感染12孔板中貼壁良好的細(xì)胞，5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h(培養(yǎng)基中無血清和雙抗)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分組：RAW264.7細(xì)胞分為對照組、H37Rv感染組和BCG感染組；THP-1細(xì)胞分為對照組、H37Rv感染組和BCG感染組。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測

胰蛋白酶消化感染后細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，洗滌后，利用平板計數(shù)，使細(xì)胞數(shù)為1×105個/mL，加入Annexin V-FITC及PI溶液，避光孵育(25 ℃，15 min)，加入Buffer，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.4qRT-PCR檢測miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)

利用Trizol法提取總RNA，檢測合格后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA,利用qRT-PCR試劑盒檢測miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)。反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Green Mix 10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后升溫至95 ℃ 15 s，降至60 ℃ 15 s，95 ℃ 20 min。每個標(biāo)本均重復(fù)檢測3次，結(jié)果取平均值，相對表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔCT法計算，見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5細(xì)胞因子檢測

利用ELISA法檢測感染12 h后[6]細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RAW264.7和THP-1細(xì)胞形態(tài)變化

RAW264.7正常細(xì)胞折光度好，邊緣清晰，感染后細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有小泡，邊界不清晰；正常THP-1細(xì)胞大小均一，細(xì)胞透亮，形態(tài)規(guī)則，包膜完整，PMA誘導(dǎo)后貼壁生長，部分細(xì)胞伸出偽足，見圖1。

A：正常RAW264.7細(xì)胞；B：Mtb感染后RAW264.7細(xì)胞；C：正常THP-1細(xì)胞；D：PMA誘導(dǎo)后THP-1細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

在THP-1細(xì)胞中，H37Rv感染組及BCG感染組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高，且BCG感染組細(xì)胞凋亡率較H37Rv感染組明顯升高(P<0.05)。在RAW264.7細(xì)胞中，H37Rv感染組及BCG感染組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高，且BCG感染組細(xì)胞凋亡率較H37Rv感染組明顯降低(P<0.05)，見圖2。

A：RAW264.7細(xì)胞對照組；B：RAW264.7細(xì)胞BCG感染組；C：RAW264.7細(xì)胞H37Rv感染組；D：THP-1細(xì)胞對照組；E：THP-1細(xì)胞BCG感染組；F：THP-1細(xì)胞H37Rv感染組；G：細(xì)胞凋亡比例；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與H37RV感染組比較。

2.3 miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)情況

與RAW264.7細(xì)胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組miR-21低表達(dá)，TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá)(P<0.05)，且BCG感染組TLR4、NF-κB mRNA較H37RV感染組表達(dá)水平更高(P<0.05)。與THP-1細(xì)胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組miR-21低表達(dá)，TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá)(P<0.05)，且BCG感染組TLR4、NF-κB mRNA較H37Rv感染組表達(dá)水平更高(P<0.05)，見圖3。

A：RAW264.7細(xì)胞mRNA表達(dá)情況；B：THP-1細(xì)胞mRNA表達(dá)情況；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與H37Rv感染組比較。

2.4 細(xì)胞因子檢測結(jié)果

與RAW264.7細(xì)胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，且BCG感染組TNF-α、IL-6表達(dá)水平較H37Rv感染組明顯降低，IL-10明顯升高(P<0.05)。與THP-1細(xì)胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，且BCG感染組TNF-α、IL-6表達(dá)水平較H37RV感染組明顯升高，IL-10明顯降低(P<0.05)，見圖4。

A：細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平；B：細(xì)胞IL-6表達(dá)水平；圖C：細(xì)胞IL-10表達(dá)水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與H37Rv感染組比較。

3 討 論

作為一種人畜共患的消耗性疾病，肺結(jié)核嚴(yán)重危害我國民眾的生命健康。近年來，由于部分耐藥Mtb的出現(xiàn)，結(jié)核病的防治工作面臨新的威脅。目前，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞是宿主控制Mtb感染散播的主要防御屏障，可吞噬Mtb，進(jìn)行消化清除[7-8]。另外，巨噬細(xì)胞在Mtb免疫逃逸中也發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致結(jié)核病的慢性癥狀，使其具有潛伏性和傳染性。靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞被抗原刺激活化，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子繼續(xù)刺激、活化巨噬細(xì)胞，吞噬Mtb，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死，引起巨噬細(xì)胞崩解，將Mtb釋放，重新被其他巨噬細(xì)胞吞噬，使Mtb得以在細(xì)胞間傳播。感染后的巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，分解為有囊膜包裹的吞噬小體，吞噬小體可降低Mtb活性，促進(jìn)機(jī)體先天性免疫反應(yīng)。RAW264.7細(xì)胞及可經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞的THP-1細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于Mtb與巨噬細(xì)胞相互作用的研究中[9]。本研究通過構(gòu)建Mtb感染巨噬細(xì)胞模型，檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，RAW264.7、THP-1細(xì)胞H37Rv感染組及BCG感染組凋亡率均明顯升高，與H37Rv感染組比較，THP-1細(xì)胞BCG感染組凋亡率明顯升高，RAW264.7細(xì)胞明顯降低，提示Mtb感染巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)其凋亡，與呂翎娜等[9]研究結(jié)果一致。

有研究顯示，TLRs信號在機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答及固有性免疫應(yīng)答中具有重要作用，與多種疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[10]。TLR4主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，可識別病原相關(guān)分子，通過胞內(nèi)信號傳遞，誘導(dǎo)免疫炎性因子，擴(kuò)大非特異性防御作用。TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MyD88依賴性和非依賴型兩條，TLR4活化后，可與MyD88羧基端TLR受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合，通過一系列磷酸化反應(yīng)，活化NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)，NIK可使NF-κB抑制蛋白泛素化降解，從而激活NF-κB，活化后的NF-κB由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-10的分泌。有研究顯示，細(xì)菌脂多糖可活化單核巨噬細(xì)胞表面TLR4，繼而激活NF-κB，誘導(dǎo)炎性因子IL-6、TNF-α釋放，參與固有免疫應(yīng)答[11]。Mtb細(xì)胞壁含有大量的分枝菌酸、脂類和多糖，可通過識別、激活巨噬細(xì)胞表面的多種受體，如TLR4等，啟動相應(yīng)的免疫防御反應(yīng)。大量研究表明，miR-21在呼吸道相關(guān)疾病中異常表達(dá)[12-13]。生物信息學(xué)顯示，miR-21可能通過靶向調(diào)節(jié)TLR-4參與機(jī)體免疫反應(yīng)。許瑞等[14]研究報道，高表達(dá)miR-21可增加下調(diào)TLR4基因的活化能力，引起通路下游NF-κB及IL-6活性降低。同時，也有研究證明，IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子可通過細(xì)胞外正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步導(dǎo)致NF-κB活化[15]。本研究結(jié)果顯示，感染后RAW264.7及THP-1細(xì)胞miR-21低表達(dá)，TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá)，且BCG感染組較H37Rv感染組miR-21低表達(dá)，TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá)，提示Mtb感染可能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，感染12 h后的RAW264.7及THP-1細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平均明顯升高；在RAW264.7細(xì)胞中，BCG感染組較H37Rv組TNF-α、IL-6表達(dá)水平明顯降低，IL-10明顯升高；在THP-1細(xì)胞中，BCG感染組較H37Rv組TNF-α表達(dá)水平明顯升高，IL-6、IL-10表達(dá)水平明顯降低，提示Mtb感染可能影響巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌。

綜上所述，Mtb感染促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，抑制機(jī)體miR-21表達(dá)，從而激活TLR-4/NF-κB信號通路。本研究選擇不同毒性的Mtb感染兩種巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明，兩種Mtb對信號通路及細(xì)胞的因子的影響有一定差異，具體原因及機(jī)制將在后續(xù)研究中展示。