湖北后河國家級自然保護區(qū)短萼黃連的分子鑒定與分析

敖智廣，韋樂華，楊 蕾，李 棟，李建斌，宋良科，廖 海，茆燦泉

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

黃連(CoptischinensisFranch)又名味連、雞爪連、川黃連等，為多年生草本植物，根狀莖黃色，常分枝，密生多數(shù)須根；葉基生，堅紙質(zhì)，卵狀三角形，三全裂，中央裂片卵狀菱形，羽狀深裂，邊緣有銳鋸齒[1]。由于歷史及各地民間用藥習(xí)慣不同，黃連藥材的植物來源比較復(fù)雜，涉及中國黃連屬植物6個種、1個變種，分別為黃連(C.chinensis)、三角葉黃連(C.deltoidea)、云南黃連(C.teeta)、峨眉黃連(C.omeiensis)、五葉黃連(C.quinquefolia)、五裂黃連(C.quinquesecta)以及短萼黃連變種(C.chinensisvar.brevisepala)，其根莖均含有較多的小檗堿而可供藥用。目前我國2015版藥典收載的藥材黃連基源植物是黃連、三角葉黃連以及云南黃連的干燥根莖[2]。市場銷售均為人工栽培，罕有野生黃連。短萼黃連作為黃連的變種，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、性狀、顯微和理化鑒定方法，效果和準確性較差。作為湖北后河國家級自然保護區(qū)新發(fā)現(xiàn)的野生黃連物種，有必要對其進行分子水平的鑒定，以確定其基原物種。

DNA條形碼(DNA barcode)分子鑒定技術(shù)是利用基因組中一段公認的、相對較短和保守的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)幾乎不受環(huán)境、被鑒定物形態(tài)等情況的影響，可以很好地彌補傳統(tǒng)鑒定方法的不足[3-4]，以ITS2 序列為主、psbA-TrnH序列為輔的中藥材分子水平鑒定方式已經(jīng)被作為中藥材DNA條形碼鑒定原則的推薦方法之一，具有操作簡易、專業(yè)技術(shù)要求不高、可批量操作、基因序列差異對比更準確，鑒定成功率高等優(yōu)勢[5-6]。DNA條形碼技術(shù)目前已經(jīng)在黃芩[7]、蛇床子[8]、石斛[9]、黃花紫堇[10]、重樓[11]等多種中藥材鑒定中廣泛應(yīng)用，但對黃連屬植物的研究較少。本研究以湖北后河國家級自然保護區(qū)野生黃連為研究對象，在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，采用ITS2和psbA-TrnH組合，對其基原進行鑒定，以期為后河保護區(qū)黃連的種質(zhì)資源保護及潛在開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品材料

從湖北、四川、云南等不同地區(qū)采集12份黃連及其易混偽物種，分別將其編號為sample 1-sample 12。所有采集樣本經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授進行形態(tài)學(xué)初步鑒定，鑒定結(jié)果見表1，樣品保存于西南交通大學(xué)樣品標本室。

表1 采集樣本形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增和測序

分別取12份樣品干燥的葉片各50.0 mg，加入液氮研磨成粉。使用天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，確定樣品DNA純度后擴增ITS2和psbA-TrnH序列。ITS2引物堿基序列(5′-3′)為，F(xiàn): ATGCGATACTTGGTGTGAAT，R:GACGCTTCTCCAGACTACAAT。psbA-TrnH引物堿基序列(5′-3′)為，F(xiàn):GTTATGCATGAACGTAATGCTC，R:CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。擴增體系為：正反引物各1.0 μL，TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，然后將合格樣品交由擎科生物科技有限公司進行雙向測序，并參照《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》[5]判斷測序峰圖質(zhì)量。

1.3 序列分析、NJ系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建、K2P距離計算以及ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用CodonCode Aligner 2.06(CodonCode Co., USA)進行序列拼接，對ITS2序列，根據(jù)Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列測序兩端5.8S和28S基因區(qū)低質(zhì)量序列，獲得完整的ITS2基因間隔區(qū)序列；用ClustalX 2.1和MEGA 7.0 進行序列比對和基于K2P(Kimura 2-parameter)雙參數(shù)模型的遺傳距離分析，用鄰接法(Neighbor joining，NJ)構(gòu)建ITS2序列系統(tǒng)聚類樹；對psbA-TrnH序列，根據(jù)中藥材DNA條形碼鑒定[12](http://www.tcmbarcode.cn/china/)確定psbA和trnH序列位置，使用軟件將兩段序列剪接，得到psbA-TrnH間隔區(qū)序列，在數(shù)據(jù)庫中進行序列比對。通過ITS2 Database網(wǎng)站[12](http//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/)的“Predict”功能進行ITS2序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種ITS2序列差異及K2P遺傳距離分析

共得到ITS2序列共82條, 其中12條為實驗樣本, 其余下載自NCBI,具體如表2所示, 不同樣本ITS2間隔區(qū)的序列長度和GC含量差異較大。毛莨科黃連屬7個物種間ITS2序列長度基本相近，為200～208 bp，且GC堿基平均含量差異不大，為65.34%～68.78%；高山唐松草和鐵破鑼雖然也屬于毛莨科，但與黃連屬相比，ITS2序列長度存在較大差異。與屬間相比，黃連屬內(nèi)保持一定的相似性。與其他易混種相比，黃連屬植株與白屈菜的ITS2序列長度最為接近，后者為209 bp；與箭葉淫羊藿的ITS2序列長度差別最大，后者為260 bp。14個物種中，樣本GC含量最高的是巖黃連，為70.91%；含量最低的是鐵破鑼，為51.42%。

表2 不同物種ITS2間隔區(qū)的序列長度和GC含量

通過ITS2序列多樣品比對，對黃連種內(nèi)及其易混種間的K2P遺傳距離進行分析。結(jié)果(表3)顯示，黃連及易混種間的K2P平均遺傳距離表現(xiàn)出明顯差異，黃連種內(nèi)平均K2P遺傳距離為0.017，短萼黃連種內(nèi)為0.008，黃連屬間為0.051，毛莨科間為0.088，毛莨科與罌粟科間為0.462，毛莨科與小檗科間為0.479。

表3 基于ITS2序列黃連種內(nèi)及其易混種間的K2P遺傳距離

4條實驗樣本(Sample1、Sample2、Sample3和Sample7)和6條NCBI下載的黃連序列(KY780696.1，KY780694.1，KY780692.1，MF096173.1，KX984000.1，KX983996.1)比對結(jié)果表明：黃連種內(nèi)有9個堿基突變位點，分別是66號T-C變異，121號T-A變異，135號G-A變異，142號C-T變異，159號T-A變異，166號G-A變異，186號T-C變異, 196號C-T變異和201號A-C變異(圖1)；1條實驗樣本(湖北后河Sample12)和8條NCBI下載的短萼黃連序列(KY780746.1，KY780725.1，KY780724.1，JN862854.1，KY780747.1，KY780745.1，KY780744.1，KY780740.1)比對分析，表明短萼黃連種內(nèi)有3個堿基突變位點，分別是70號C-T變異, 87號T-C/G變異以及130號A-G變異(圖2)。

(a)、(b)和(c)分別為黃連1～70、71～140、141～206位點堿基序列，其中sample 1、sample 2、sample 3和sample 7為采集樣本，其余序列下載自NCBI數(shù)據(jù)庫

(a)、(b)和(c)分別為短萼黃連1～70、71～140、141～200位點堿基序列，其中sample 12為后河采集樣本，其余序列下載自NCBI數(shù)據(jù)庫

2.2 物種psbA-TrnH序列數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

將12個樣本的psbA-TrnH序列，放入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中進行序列比對，自動匹配出與目標序列最為接近的物種序列及相關(guān)信息。sample 1、sample 2、sample 3、sample 7、sample 8和sample 10與數(shù)據(jù)庫中黃連最為接近，序列相似性為95.7%～98.2%；后河采集樣本sample 12與數(shù)據(jù)庫中三角葉黃連最為接近，序列相似性為97.5%，與短萼黃連相似性為93.6%；sample 4、sample 5和sample 6僅能鑒定為黃連屬，與黃連屬序列相似性為100%；sample 9與數(shù)據(jù)庫中紫堇屬最為接近，序列相似性為89.6%～96.0%；sample 11與唐松草屬最為接近，序列相似性為94.4%～100%。

2.3 系統(tǒng)進化發(fā)育樹

基于82個樣本的ITS2序列，通過鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。黃連屬及其易混偽種可以很好地區(qū)分開，整體分為3大支。峨眉黃連單獨聚為一支；短萼黃連、日本黃連、黃連和云南黃連聚為一大類；高山唐松草、五裂黃連、白屈菜、鐵破鑼、三角葉黃連、箐邊紫堇、箭葉淫羊藿以及黃疸樹聚為一大類。采集的樣本sample 1、sample 2、sample 3和sample 7和黃連聚為一支，bootstrap支持率為98%；sample 6和峨眉黃連聚為一支，bootstrap支持率為91%；后河采集樣本sample 12和短萼黃連聚為一支，bootstrap支持為90%；sample 4和sample 5和三角葉黃連聚為一支，bootstrap支持率分別為100%和66%；sample 8和sample 10與箐邊紫堇聚為一支，bootstrap支持率為99%；sample 9和sample 11單獨聚為一支。以上結(jié)果是從分子進化角度進一步對分類進行了驗證，揭示湖北后河國家級自然保護區(qū)野生黃連屬于短萼黃連。

支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%

2.4 ITS2序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

在ITS2 database二級結(jié)構(gòu)預(yù)測數(shù)據(jù)庫中選取黃連及其7個易混品種，對其ITS2二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測, 結(jié)果見圖4。

(a)從左往右依次為黃連、巖黃連、峨眉黃連、高山唐松草；(b)從左往右依次為短萼黃連、三角葉黃連、五裂黃連、云南黃連

通過比對ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)，可以看出8個物種的ITS2二級結(jié)構(gòu)較為相似，都符合具有一個主環(huán)、4個主臂、外加2個邊環(huán)的特征，且在各主臂上有著大小、長度不一的莖、環(huán)結(jié)構(gòu)。1號黃連的主臂為I、II、III和V，其中臂III最長，兩個多分支環(huán)，臂上環(huán)總計17個。2號巖黃連ITS2二級結(jié)構(gòu)主臂分別為I、II、III和V，其中主臂III最長，3個多分支環(huán)，臂上環(huán)結(jié)構(gòu)總計16個。3號峨眉黃連主臂分別為I、II、III和V，其中臂III最長，兩個多分支環(huán)結(jié)構(gòu)，臂上的環(huán)結(jié)構(gòu)總計12個。4號高山唐松草主臂分別為I、II、III和IV，其中臂III最長，兩個多分支環(huán)結(jié)構(gòu)，臂上環(huán)結(jié)構(gòu)總計11個。6號三角葉黃連的主環(huán)明顯比其他黃連近緣物種的ITS2序列二級結(jié)構(gòu)的主環(huán)大。8號云南黃連的主要結(jié)構(gòu)為一個主環(huán)，外加4個不大的主臂，結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于其他的黃連物種。云南黃連生存環(huán)境惡劣，推測其二級結(jié)構(gòu)與其在片段化的居住環(huán)境中有關(guān)，云南黃連現(xiàn)已列為瀕危物種。5號短萼黃連與7號五裂黃連的主臂與其他種屬黃連的主臂不同，其他種屬黃連的主臂有較多數(shù)量的環(huán)結(jié)構(gòu)和多分支環(huán)，短萼黃連的多分支環(huán)為VI環(huán)和IV環(huán)，三角葉黃連為V環(huán)，五裂黃連的多分支環(huán)為V環(huán)，且五裂黃連主臂上的環(huán)結(jié)構(gòu)更多、更大。

3 討論

加拿大科學(xué)家 Paul Herbert于2003年提出了DNA條形碼技術(shù)，在生物物種分類與鑒定研究領(lǐng)域得到了迅速應(yīng)用。該技術(shù)利用短的、標準的 DNA 序列可為動植物來源的中藥材提供快速、準確的鑒定[13]。中國藥典2015版和中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[5]指出，利用ITS2序列鑒定中藥材植物的成功率高于psbA-TrnH序列。為此，本研究對于湖北后河自然保護區(qū)野生黃連的鑒定，在形態(tài)學(xué)初步鑒定的基礎(chǔ)上，進一步采用了ITS2序列鑒定為主，psbA-TrnH序列鑒定為輔的策略。

經(jīng)過ITS2多序列比對和K2P遺傳距離分析，可以發(fā)現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間遺傳距離，屬內(nèi)遺傳距離明顯小于屬間遺傳距離，科內(nèi)遺傳距離明顯小于科間遺傳距離，表明了ITS2序列作為黃連屬植株主要鑒定手段是準確可靠的。劉曉光[14]認為單一的ITS、matK、trnH-psbA和rbcL 4條片段僅能將黃連屬4種1變種中的云南黃連與其他種區(qū)分開。李波等[2]研究發(fā)現(xiàn)多片段組合鑒定可以提高鑒定準確率，且能夠有效區(qū)分中藥黃連的原植物，即三角葉黃連、云南黃連和黃連。本研究12個采集樣本的7個樣本經(jīng)psbA-TrnH序列數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，與形態(tài)學(xué)鑒定、ITS2序列鑒定結(jié)果完全一致。短萼黃連作為黃連的變種，我們也將短萼黃連ITS2序列與黃連進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多堿基位點存在差異，表明黃連屬間差異性顯著大于種內(nèi)，ITS2序列鑒定結(jié)果可靠。研究發(fā)現(xiàn)：后河樣本sample 12通過ITS2序列鑒定，與形態(tài)學(xué)初步鑒定結(jié)果一致，均為短萼黃連；而作為輔助鑒定psbA-TrnH序列，只能鑒定其為黃連屬植株，且與三角葉黃連最為接近。這與劉曉光[14]的研究結(jié)果一致，可能是由于黃連屬植株psbA-TrnH序列保守性不如ITS2序列保守性以及測序的準確性有關(guān)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示：短萼黃連、日本黃連、黃連和云南黃連親緣關(guān)系較近，且ITS能夠很好地區(qū)分黃連及其變種短萼黃連；而五裂黃連和三角葉黃連和其他的易混品種不能很好地區(qū)分，如果采用更多的條形碼片段組合加以鑒定，或許能夠很好地解決這一問題。同時本研究還首次針對短萼黃連在內(nèi)的7個近緣物種進行了ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并對ITS2的二級結(jié)構(gòu)進行分析，以期解決更高級分類時多序列比對困難問題[15]。研究結(jié)果顯示：7個物種，短萼黃連與黃連的ITS2二級結(jié)構(gòu)最為相似，與云南黃連的二級結(jié)構(gòu)相差最遠，并且三角葉黃連和五裂黃連與其他黃連屬植株的ITS2結(jié)構(gòu)存在顯著差異，這也可能是導(dǎo)致進化樹無法完全將其與巖黃連和白屈菜等易混物種區(qū)分開的重要原因。

短萼黃連和黃連同屬國家三級保護植物，在中國植物紅皮書中瀕危級別為漸危。本研究表明對于黃連及其變種短萼黃連，無論是專家形態(tài)學(xué)鑒定，ITS2序列鑒定還是psbA-TrnH序列鑒定均能起到一定的作用，而將3種鑒定方法有機結(jié)合，能夠更精準地鑒定相關(guān)物種[16-17]。成功鑒定了湖北后河新發(fā)現(xiàn)野生黃連物種為短萼黃連，不僅對湖北后河國家級自然保護區(qū)的物種發(fā)現(xiàn)與鑒定有著重要意義，而且也為保護區(qū)黃連種質(zhì)資源的保護和合理開發(fā)利用提供必要的理論依據(jù)。

致謝:感謝湖北后河國家級自然保護區(qū)、中國林科院森林環(huán)保所的項目和工作支持。