植物乳桿菌UD01對(duì)具核梭桿菌生物膜形成的抑制

鐘焱婷, 楊 虹

(上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240)

口臭是臨床常見癥狀，在成年人中發(fā)病率約為25%[1]。具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)是引起口臭的致病菌之一，它能降解含硫氨基酸生成難聞的揮發(fā)性硫化物(VSCs)[2]，更重要的是，它在口腔菌斑生物膜形成的過(guò)程中，起到橋接早晚期定植菌、為晚期定植的厭氧菌提供結(jié)合位點(diǎn)的重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在缺乏具核梭桿菌的情況下，其他致臭菌如牙齦卟啉單胞菌等晚期定植菌黏附率顯著降低[3]。生物膜狀態(tài)的菌株抗逆性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于浮游細(xì)菌[4]。因此，具核梭桿菌形成生物膜是造成口臭的關(guān)鍵，而抑制其生物膜為緩解口臭提供了可能性。

臨床上治療口臭主要采用機(jī)械法和化學(xué)法，存在復(fù)發(fā)率高、副作用較多等問(wèn)題，有待開發(fā)如益生菌生物制劑等方法。研究表明，部分益生菌，如食竇魏斯氏菌[5]、唾液鏈球菌K12[6]、乳酸乳球菌[7]能通過(guò)抑制致臭菌生長(zhǎng)或中和 VSCs從而緩解口臭。然而，目前尚沒(méi)有益生菌作用于致臭菌生物膜的研究，而致臭菌形成生物膜是口臭不易治療的主要原因之一[8]。

近年來(lái)，如何有效抑制致病菌生物膜形成已成為研究熱點(diǎn)，生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，分為初始黏附、微集落形成以及生物膜的成熟與分散等3個(gè)階段，初始黏附與菌體表面蛋白、多肽、黏附素等密切相關(guān)，EPSs對(duì)微集落形成和生物膜結(jié)構(gòu)的發(fā)展至關(guān)重要[9-10]。具核梭桿菌存在多個(gè)與生物膜形成相關(guān)的外膜蛋白，其中，radD[11]、fap2[12]、aim1[13]和cmpA[14]基因編碼4個(gè)類自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，fomA[15]基因編碼孔蛋白，fadA[16]基因編碼黏附素，均被證實(shí)具有介導(dǎo)黏附的功能，與生物膜初始黏附相關(guān)。

本研究從多株益生菌中篩選到一株在中性 pH(pH 6.6)條件下仍能有效抑制具核梭桿菌生物膜形成的植物乳桿菌UD01，初步探究該菌株如何抑制具核梭桿菌生物膜形成，以期為益生菌用于緩解口臭提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)菌株由嘉興益諾康生物科技有限公司提供：植物乳桿菌LactobacillusplantarumZM02；唾液乳桿菌LactobacillussalivariusZM06；唾液鏈球菌StreptococcussalivariusZM252；嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilusZM236；植物乳桿菌LactobacillusplantarumUD01；唾液乳桿菌LactobacillussalivariusUD06。

具核梭桿菌(F.nucleatumATCC 25586)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。

1.1.2 試劑

MRS 培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；TSB 培養(yǎng)基購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；無(wú)菌脫纖維羊血購(gòu)于南京茂捷微生物科技有限公司；SYTO-9染料購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海生工生物股份有限公司；RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit購(gòu)于天根生化科技有限公司；TransScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis、TransStart Top Green qPCR SuperMix均購(gòu)于北京全式金生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

1)益生菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備?；罨蟮囊嫔臧?%接種量接種于MRS肉湯，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，4 ℃、500 r/min離心5 min，NaOH(1mol/L)調(diào)節(jié)上清液pH值至6.6±0.02，并用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

2)生物膜形成實(shí)驗(yàn)。取100 μLF.nucleatum菌液(1×107CFU/mL)加入96孔板，再加入50 μL益生菌 CFS(pH 6.6)、50 μL TSB肉湯，以MRS肉湯(pH 6.6)作為對(duì)照。培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液，200 μL PBS洗滌3次；100 μL甲醇固定15 min后，吸出甲醇，晾干；100 μL體積分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫染色5 min后，吸去結(jié)晶紫并沖洗干凈；37 ℃倒置烘干；100 μL體積分?jǐn)?shù)為33%的冰乙酸37 ℃溶解30 min；檢測(cè)OD590。

1.2.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對(duì)具核梭桿菌生物膜形成的抑制作用

1)MBIC的確定。96孔板的第1列加入100 μL UD01 CFS(pH 6.6)，以MRS(pH 6.6)肉湯作為對(duì)照；第1～5列加入100 μL TSB肉湯，倍比稀釋法將第1列液體混勻后取100 μL加入第2列，依次進(jìn)行直到第4列，第4列液體混勻后棄去100 μL；在96孔板的第1～5列中各接入100 μLF.nucleatum菌液(1×107CFU/mL)。24 h后按1.2.1節(jié)生物膜形成試驗(yàn)的方法測(cè)定生物膜量。顯著抑制F.nucleatum生物膜形成的UD01 CFS(pH 6.6)的最低體積濃度為MBIC[17]。

2)生物膜結(jié)構(gòu)觀察。在24孔板中央放置直徑8 mm的蓋玻片，加入500 μL TSB肉湯、1 mLF.nucleatum菌液(1×107CFU/mL)、500 μL UD01CFS(pH 6.6、MBIC濃度)，以MRS肉湯(pH 6.6)作為對(duì)照；培養(yǎng)24 h后，PBS清洗生物膜3次；置于戊二醛(體積分?jǐn)?shù)為2.5%)中4 ℃過(guò)夜；梯度乙醇洗脫；臨界點(diǎn)干燥，噴金；SEM觀察。

3)生物膜厚度測(cè)定。按生物膜結(jié)構(gòu)觀察試驗(yàn)的方法制取、洗滌F.nucleatum生物膜；暗室中加入200 μL SYTO-9染料，避光孵育20 min；吸去染液、PBS洗滌 1次；樣品有生物膜的一面朝下蓋在20 mm×20 mm的蓋玻片上；CLSM對(duì)生物膜Z軸方向掃描成像。

1.2.3 探究UD01上清液在中性 pH 條件下抑制具核梭桿菌生物膜形成的機(jī)制

1)生長(zhǎng)曲線。調(diào)節(jié)TSB肉湯使其含有MBIC濃度的UD01 CFS(pH 6.6)，對(duì)照組含有等量MRS肉湯(pH 6.6)，接種F.nucleatum至菌濃度為5×106CFU/mL，37 ℃厭氧孵育，每隔2 h測(cè)菌液OD600，繪制生長(zhǎng)曲線。

2)熒光定量PCR。按生物膜結(jié)構(gòu)觀察試驗(yàn)的方法制取、洗滌F.nucleatum生物膜，用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit試劑盒提取生物膜RNA，TransScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體步驟按說(shuō)明書操作。qPCR引物序列如表1，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火15 s，68 ℃ 延伸20 s，循環(huán)40次。以16S rRNA作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)中的引物

3)胞外EPSs含量測(cè)定。

①熱處理法提取生物膜EPSs[18]：PBS洗滌生物膜3次，將生物膜全部吹打下來(lái)并調(diào)節(jié)至OD600為2.0±0.01的菌懸液；取1 mL菌懸液80 ℃水浴30 min；5 000 r/min離心15 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾后即為EPSs提取液。另取30 mL 生物膜懸液，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀80 ℃烘干至恒重E1，每毫升F.nucleatum生物膜菌懸液干重為W1=E1/30。

②Bradford法測(cè)定胞外蛋白：按照Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度α，再根據(jù)樣品體積和干重計(jì)算生物膜胞外蛋白含量P(μg/mg)=α×1 mL/W1。

③硫酸苯酚法測(cè)定胞外多糖：配制5～120 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或EPSs提取液加入具塞試管，以ddH2O作為空白對(duì)照；加入1 mL苯酚(體積分?jǐn)?shù)為5%)振蕩10～20 s；加入5 mL濃硫酸，沸水浴15 min后測(cè)定OD490；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的多糖濃度β，生物膜胞外多糖含量R(μg/mg)=β×1 mL/W1。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

6株待篩選的益生菌中僅有UD01CFS(pH 6.6)對(duì)F.nucleatum生物膜的抑制效果是顯著的，故將UD01作為后續(xù)試驗(yàn)菌株(表2)。

表2 益生菌上清液在中性 pH 條件下對(duì)具核梭桿菌生物膜的抑制

2.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對(duì)具核梭桿菌生物膜形成的抑制作用

2.2.1 MBIC的確定

抑制生物膜的研究通常以藥物的MBIC水平進(jìn)行[17]，當(dāng)UD01 CFS(pH 6.6)稀釋至濃度達(dá)到25%原液，F(xiàn).nucleatum生物膜形成量顯著下降，且此濃度下對(duì)照組的生物膜形成量不受影響(圖1)，由此確定UD01 CFS(pH 6.6)對(duì)F.nucleatum生物膜的MBIC為250 μL/mL。

圖1 UD01上清液(pH 6.6)對(duì)具核梭桿菌生物膜形成的最低抑制濃度

2.2.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對(duì)具核梭桿菌生物膜結(jié)構(gòu)和厚度的影響

1)掃描電鏡試驗(yàn)。對(duì)照組F.nucleatum生物膜結(jié)構(gòu)致密[圖2(b)(d)]，而試驗(yàn)組結(jié)構(gòu)疏松，菌體間存在較大間隙[圖2(a)(c)]，且在制備 SEM 樣品過(guò)程中，易被水流破壞，說(shuō)明 UD01 CFS(pH 6.6)導(dǎo)致其對(duì)玻片的黏附力降低。

(a)試驗(yàn)組(1 000×)；(b)對(duì)照組(1 000×)；(c)試驗(yàn)組(3 000×)；(d)對(duì)照組(3 000×)

2)激光共聚焦顯微鏡試驗(yàn)。對(duì)照組生物膜最大厚度將近16 μm[圖3(b)]，實(shí)驗(yàn)組生物膜的最大厚度僅為10 μm左右[圖3(a)]，UD01 CFS(pH 6.6)導(dǎo)致F.nucleatum生物膜變薄。

(a)試驗(yàn)組；(b)對(duì)照組

2.3 UD01上清液在中性 pH條件下抑制具核梭桿菌生物膜形成的機(jī)理探究

2.3.1 UD01上清液在中性 pH條件下對(duì)具核梭桿菌生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)組F.nucleatum生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組基本一致(圖 4)，說(shuō)明UD01 CFS(pH 6.6)無(wú)法抑制F.nucleatum生長(zhǎng)。

圖4 UD01上清液在中性 pH條件下對(duì)具核梭桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

2.3.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對(duì)具核梭桿菌外膜黏附相關(guān)蛋白的影響

F.nucleatum外膜黏附相關(guān)蛋白基因表達(dá)均顯著下調(diào)，其中，cmpA基因表達(dá)下調(diào)了10 倍以上。提示UD01 CFS(pH 6.6)可能通過(guò)影響初始黏附，進(jìn)而抑制F.nucleatum生物膜形成(圖5)。

圖5 UD01上清液在中性pH條件下對(duì)具核梭桿菌黏附相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.3 UD01上清液在中性 pH 條件下對(duì)具核梭桿菌生物膜EPSs的影響

細(xì)菌通過(guò)生長(zhǎng)增殖過(guò)程中產(chǎn)生的EPSs將單個(gè)菌粘連成微集落，大量微集落逐漸形成生物膜結(jié)構(gòu)并不斷增厚。實(shí)驗(yàn)組胞外蛋白和多糖的含量均顯著降低，推測(cè)UD01 CFS(pH 6.6)可以通過(guò)減少胞外蛋白和多糖含量來(lái)抑制F.nucleatum生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)展(圖6)。

圖6 UD01 上清液在中性 pH 條件下對(duì)具核梭桿菌生物膜EPSs含量的影響

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)用益生菌均為乳酸菌，其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量有機(jī)酸，目前研究證實(shí)這些酸性物質(zhì)雖然能抑制致病菌生物膜形成，然而，一旦pH值上升后作用效果不佳，如Nostro等[19]研究表明乙酸、乳酸在上調(diào)pH值后，對(duì)金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用均下降。生理學(xué)指出健康口腔pH值范圍為6.6～7.1[20]，益生菌在口腔中使用可能會(huì)受到口腔中性pH環(huán)境的影響，使得有機(jī)酸等活性物質(zhì)無(wú)法發(fā)揮作用。因此，益生菌需存在除酸以外的活性物質(zhì)，才能在口腔中發(fā)揮功效，以口腔pH值作為前提條件篩選菌株與益生菌的實(shí)際應(yīng)用更貼合。另外體外試驗(yàn)中用于培養(yǎng)具核梭桿菌的 TSB 肉湯pH約7.2，為確保益生菌上清液與 TSB 肉湯混合后酸堿度在口腔中性 pH 范圍內(nèi)，將益生菌上清液 pH值調(diào)至6.6，最終篩選出一株植物乳桿菌 UD01，其上清液(pH 6.6)顯著抑制具核梭桿菌生物膜形成。

現(xiàn)階段關(guān)于抑制生物膜的機(jī)制研究，多數(shù)有效成分是通過(guò)抑菌或殺菌機(jī)制來(lái)抑制細(xì)菌生物膜的形成[21-22]，然而生長(zhǎng)曲線顯示 UD01 CFS(pH 6.6)無(wú)法抑制具核梭桿菌生長(zhǎng)，這與李琛等[23]發(fā)現(xiàn)右旋氨基酸在不影響牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)的同時(shí)抑制其生物膜形成的情況相類似，說(shuō)明其不是通過(guò)減少具核梭桿菌數(shù)量抑制生物膜的。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)，一些活性物質(zhì)，如唾液乳桿菌[24]、槲皮素[25]，能通過(guò)下調(diào)與生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)或影響 EPSs含量來(lái)抑制變異鏈球菌或單增李斯特菌生物膜形成，結(jié)合 qPCR 和 EPSs含量測(cè)定試驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)UD01 CFS(pH 6.6)既減少了具核梭桿菌生物膜胞外蛋白和多糖分泌量，又削弱了其黏附相關(guān)基因的表達(dá)水平。

本研究篩選出一株在口腔中性pH時(shí)仍能有效抑制具核梭桿菌生物膜形成的植物乳桿菌UD01，該菌株能通過(guò)下調(diào)具核梭桿菌黏附相關(guān)基因表達(dá)、降低 EPSs含量來(lái)減少具核梭桿菌生物膜形成，并使其致密度顯著疏松，厚度變薄。