基于藥物重定位策略預(yù)測治療多發(fā)性骨髓瘤的候選化合物

鄒 敏，李銳峰，陳 岷，顏曉燕，史惠卿

(1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 成都 610500; 2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院 藥學(xué)部, 成都 610072;3.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院, 成都 610083)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種B細(xì)胞腫瘤，是世界上第二常見的血液學(xué)惡性腫瘤[1]，2016年美國估計(jì)有13 000人死于多發(fā)性骨髓瘤[2]，MM的發(fā)病率因國家、人種的不同而有較大差別，而我國尚無MM發(fā)病率的確切流行病學(xué)調(diào)查資料，一般估計(jì)與周邊的東南亞和日本的發(fā)病率相近，約為1/100 000。雖然近年來提高了新診斷患者的中位生存期，使得過去十年中患者的中位生存期從3～4年提高到7～8年[3]，但骨骼病變及其后遺癥仍然是患者發(fā)病率和死亡率的主要來源，骨痛是MM患者最常見的表現(xiàn)癥狀[4]。因此，迫切需要開發(fā)一種有效的治療MM的策略和篩選出治療MM的候選化合物。

藥物重定位(Drug repositioning，DR)是傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)的輔助過程，已引起學(xué)術(shù)界和制藥公司的廣泛關(guān)注。藥物重定位，也稱為“藥物再利用或藥物再循環(huán)”，是通過鑒定已知藥物的新治療應(yīng)用來克服發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新藥的障礙。重定位的候選藥物已經(jīng)建立了配方和制造方法、廣泛的藥代動(dòng)力學(xué)特性、已知的不良反應(yīng)、臨床試驗(yàn)信息和上市后監(jiān)測安全性數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)都使得藥物開發(fā)變得更容易且失敗的可能性更小[5-6]。在MM治療中，利用藥物重定位策略，一些針對新適應(yīng)癥的老藥物已經(jīng)被開發(fā)，通過藥物重定位發(fā)現(xiàn)使用沙利度胺藥物可延長MM的存活時(shí)間，已被證實(shí)對難治性MM有效。另外，馬法蘭和潑尼松龍聯(lián)合沙利度胺也是老年MM患者有效的一線治療方法[5]。因此，利用藥物重定位策略來預(yù)測治療MM的候選化合物是可行和有效的。此外，大規(guī)模擾動(dòng)數(shù)據(jù)庫為計(jì)算生物學(xué)和藥物重定位提供了很好的機(jī)會(huì)[7]，CMAP是一種計(jì)算藥物重定位工具。

本研究利用CMAP連接圖計(jì)算治療MM的候選化合物。通過基因表達(dá)和基于公開數(shù)據(jù)庫的蛋白-蛋白表達(dá)分析來識(shí)別與MM相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，通過CMAP連接圖計(jì)算得到MM相關(guān)的候選化合物。最后利用文本挖掘的方法，對這些差異表達(dá)基因和候選化合物進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)的獲取

本研究的芯片數(shù)據(jù)集來自GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以multiple myeloma和normal為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索與MM相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，并最終篩選出3個(gè)樣本集。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

利用在線GEO2R分別對3個(gè)樣本集進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。利用Excel對3個(gè)樣本集基因進(jìn)行篩選，設(shè)置參數(shù)為P值小于或等于0.05，log2FC大于或等于2，或者小于或等于-2。將大于或等于2定義為上調(diào)差異表達(dá)基因，小于或等于-2定義為下調(diào)差異表達(dá)基因。利用韋恩圖對3個(gè)樣本集進(jìn)行交集。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集分析和通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)和panther數(shù)據(jù)庫(http://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.do)在基因功能層面對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。將差異表達(dá)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫中，并將基因名轉(zhuǎn)化為official_gene_symbol，選取gene_ontology中的GOTERM_BP_FAT(生物過程)，GOTERM_MF_FAT(分子功能)，GOTERM_CC_FAT(細(xì)胞成分)進(jìn)行GO富集分析，

將差異表達(dá)基因輸入panther數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的建立和模塊分析

將篩選出的差異表達(dá)基因輸入string(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將STRING所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入cytoscape軟件，通過cytoscape中的MCODE模塊功能得出蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)模塊分析。

1.5 根據(jù)差異表達(dá)基因篩選候選化合物

將GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出來的10個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因和43個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因分別輸入https://www.affymetrix.com/site/login/login.affx?toURL=/analysis/netaffx/batch_query.affx?netaffx=netaffx4_annot，在HG-U133A平臺(tái)上檢測到16個(gè)上調(diào)探測集和87個(gè)下調(diào)探測集作為多發(fā)性骨髓瘤的“查詢簽名”。將基因轉(zhuǎn)換為探針(grp文件)后導(dǎo)入cmap(https://portals.broadinstitute.org/cmap/)連接圖，計(jì)算得到6 100個(gè)候選化合物，分?jǐn)?shù)為-1的為與疾病最相關(guān)的候選化合物，對前20種候選化合物進(jìn)一步分析。將前20種候選化合物輸入DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)和stitch數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de/)進(jìn)行查找驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)譜分析

本研究選擇了3個(gè)基因表達(dá)譜(GSE47552, GSE36474, GSE6477)。其中，GSE47552為41個(gè)MM標(biāo)本和9個(gè)正常標(biāo)本，GSE16558為60個(gè)MM標(biāo)本和5個(gè)正常標(biāo)本，GSE6477為126個(gè)MM標(biāo)本和15個(gè)正常標(biāo)本。

表1 來自GEO數(shù)據(jù)庫的3個(gè)基因表達(dá)譜的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

2.2 獲取差異表達(dá)基因

從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得篩選基因后，通過韋恩圖交集(2個(gè)及以上)后獲得了差異共表達(dá)基因53個(gè)，其中上調(diào)差異表達(dá)基因10個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因43個(gè)，具體如圖1和圖2所示。

圖1 上調(diào)基因

圖2 下調(diào)基因

2.3 GO功能分析

差異表達(dá)基因DAVID數(shù)據(jù)庫分析得出有代表性的GO類別(表2)。GO分析結(jié)果顯示：生物學(xué)過程包括22條，主要涉及免疫反應(yīng)，細(xì)胞表面受體連鎖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)……淋巴激活等；分子功能包括5條，主要涉及趨化因子受體結(jié)合，趨化因子活性，生長因子活性，細(xì)胞因子活性；細(xì)胞成分包括5條，主要涉及細(xì)胞外區(qū)域、高爾基體、固有質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)囊泡部分，細(xì)胞外間隙。

表2 MM患者中差異表達(dá)基因的GO分析

2.4 KEGG通路分析

將篩選出的差異表達(dá)基因輸入panther進(jìn)行分析，得到具有代表性的KEGG通路(表3)。KEGG結(jié)果如下：由Slit/Robo介導(dǎo)的軸突導(dǎo)向；B細(xì)胞激活；血管生成；p53通路；由趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的炎癥；p38MAPK通路；異三聚體g-蛋白信號(hào)通路-gq和Go-alpha介導(dǎo)通路；p53通路反饋回路2；PI3K通路；內(nèi)皮素信號(hào)通路。

2.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的模塊分析

String和cytoscape做出蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖3和圖4所示，其中VCAM1、CCR2、CCL3和CXCL12 等4個(gè)基因?yàn)楦患潭茸罡叩暮诵牟町惐磉_(dá)基因。VCAM1(血管細(xì)胞黏附分子1)：VCAM1/ITGA4/ITGB1相互作用可能在免疫反應(yīng)和白細(xì)胞向炎癥部位遷移中發(fā)揮病理生理作用。CCR2(趨化因子受體2)：是CCL2、CCL7和CCL13趨化因子的受體，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。CCL3(趨化因子配體3)為具有炎癥和化學(xué)動(dòng)力學(xué)特性的單核因子。CXCL12(趨化因子配體12)為化學(xué)引誘物，對T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞有活性，但不對中性粒細(xì)胞有活性。

圖4 蛋白-蛋白相互作用相關(guān)模塊分析

表 3 KEGG分析

圖3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 前20種候選化合物分析

將差異表達(dá)上調(diào)和下調(diào)基因分別轉(zhuǎn)化為探針后導(dǎo)入cmap，經(jīng)運(yùn)算獲得6 100種候選化合物。對前20種候選化合物進(jìn)行研究(根據(jù)SCORE分?jǐn)?shù)排名)，結(jié)果(表4)顯示，其中的LY-294002和tanespimycin與MM的治療相關(guān)。

表4 前20種候選化合物

由stitch數(shù)據(jù)庫獲得與LY294002相關(guān)蛋白，如圖5所示：Pik3ca，Pik3cb，Pik3cg，Pik3cd；AKT1；Mtor；Gsk3b；Foxo3；Rps6kb1相關(guān)蛋白。由stitch數(shù)據(jù)庫獲得與tanespimycin相關(guān)蛋白，如圖6所示: HSP90AB1和 HSP90AA1；AKT1；TP53CCND1；ERBB2等相關(guān)蛋白。

圖5 與LY294002相關(guān)蛋白

圖6 與tanespimycin相關(guān)蛋白質(zhì)

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種漿細(xì)胞克隆的惡性疾病。由于其多藥耐藥和疾病復(fù)發(fā)，MM仍無法治愈，因此確定MM新的特異性靶向治療方法和發(fā)現(xiàn)新的候選化合物至關(guān)重要。

本研究通過基因表達(dá)和基于公開數(shù)據(jù)庫的蛋白-蛋白表達(dá)分析來識(shí)別與MM相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，通過CMAP計(jì)算得到MM相關(guān)的候選化合物?；贕EO數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出MM與正常人組織之間的差異表達(dá)基因。共鑒定了10個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因和43個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因。這些差異表達(dá)基因與GO富集生物學(xué)過程中磷酸化的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)等密切相關(guān)，與分子功能中趨化因子活性密切相關(guān)，并且在KEGG中顯著富集p53、p38MAPK和PI3K通路。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)確定了4個(gè)中樞基因，包括VCAM1、CCR2、CCL3和CXCL12。最后，通過CMAP連接圖對這些差異表達(dá)基因的計(jì)算得到與MM相關(guān)的候選化合物。其中LY294002(與MM負(fù)相關(guān)性最強(qiáng))和tanespimycin(出現(xiàn)次數(shù)最多)可能對MM有潛在的治療作用。

p53途徑由數(shù)百種基因及其產(chǎn)物組成，可響應(yīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老或細(xì)胞周期阻滯等信號(hào)。磷脂酰肌醇3-激酶途徑(PI3-K)是一個(gè)涉及的關(guān)鍵途徑，它涉及細(xì)胞膜磷脂組分的磷酸化，這些磷脂組分作為連接蛋白到質(zhì)膜的對接位點(diǎn)，并隨后激活信號(hào)級(jí)聯(lián)[8]，這與本研究所得GO分析分子功能的磷酸化調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)相一致。PI3K/Akt途徑是細(xì)胞功能的關(guān)鍵途徑，直接抑制PI3K，已經(jīng)在細(xì)胞系和動(dòng)物模型中顯示出腫瘤的抑制和消退，并且包括SF1126的多種藥劑目前正在臨床試驗(yàn)中[9]。臨床前研究表明抑制p38可抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥和促凋亡細(xì)胞因子，p38信號(hào)在MM的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10]。因此，阻斷這些通路可能是治療MM的一種新策略。

對4個(gè)基因進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，Zhang等[11]確定了與MM相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基因，包括CD4、HLA-DRB1、TFRC和VCAM1，它們可能通過免疫介導(dǎo)的途徑在MM進(jìn)展中發(fā)揮作用，其中VCAM1與本研究所得結(jié)果一致。人類MM細(xì)胞至少表達(dá)3種不同的趨化因子受體，即CCR1、CCR2和CXCR4。它們不僅參與細(xì)胞遷移，而且還介導(dǎo)在血管外組織室中遷移細(xì)胞的保留[12]。該研究的CCR2與本研究一致，分子功能的趨化因子活性可能與CCR2有關(guān)，與GO分析生物學(xué)過程細(xì)胞遷移相關(guān)。CXCL12被認(rèn)為可以刺激破骨細(xì)胞前體的遷移，并上調(diào)幾個(gè)前破骨細(xì)胞基因[13]。CXCL12是由骨髓內(nèi)的幾種細(xì)胞類型分泌的，這種表達(dá)在幾種轉(zhuǎn)移性癌癥的向骨性介導(dǎo)中得到了很好的證實(shí)[14]。CXCL12在MM細(xì)胞中高度表達(dá)，CXCL12的中和阻止了MM在骨內(nèi)的歸巢和生長[15]。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致。然而，這些基因在MM中的作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

LY294002是1種含嗎啉的化合物，是磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)的抑制劑?；赑I3-K與維持MM腫瘤本質(zhì)的關(guān)鍵機(jī)制之間的關(guān)系，PI3K抑制的治療可能為未來的治療策略提供令人興奮的前景[16]。LY294002通過抑制在黏附過程中異常激活的PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)海普林抗骨髓瘤作用，這可能是一種新的MM臨床治療方法[17]。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)LY294002可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266增殖。Stitch蛋白質(zhì)結(jié)果表明LY294002通過激活參與細(xì)胞生長和增殖的信號(hào)級(jí)聯(lián)，在B細(xì)胞發(fā)育、增殖、遷移和功能發(fā)揮作用。其次，tanespimycin是一種熱休克蛋白90(HSP90)的小分子抑制劑,是一種依賴ATP的分子伴侶蛋白，包括許多與癌相關(guān)的激酶和轉(zhuǎn)錄因子，是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[19]。Tanespimycin也與HSP90結(jié)合，并在體外和體內(nèi)產(chǎn)生抗腫瘤作用。Tanespimycin可能是治療復(fù)發(fā)/難治性MM最具潛力的化合物[20]。分析Stitch蛋白質(zhì)也表明，tanespimycin通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂等過程發(fā)揮作用。因此，LY294002和tanespimycin有望成為治療MM的候選化合物。

4 結(jié)論

綜上，本研究通過GEO、DAVID、PANTHER、STRING數(shù)據(jù)庫，cytoscape軟件，cmap連接圖，drugbank，STITCH數(shù)據(jù)庫等多種生物信息學(xué)工具對基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了篩選、整合、挖掘和分析，探索MM相關(guān)差異表達(dá)基因、信號(hào)通路和功能模塊、候選化合物和作用機(jī)制等，從多個(gè)角度分析MM的表達(dá)特征。研究結(jié)果表明：激酶活性、磷酸化調(diào)節(jié)和趨化因子活性等可能與MM的發(fā)展密切相關(guān)；p53、p38KAPK、PI3K 通路與MM有密切關(guān)系，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等，而誘導(dǎo)MM瘤細(xì)胞凋亡；VCAM1、CCR2、CCL3、CXCL12基因可作為 MM治療的潛在靶點(diǎn)，LY294002和tanespimycin有望成為MM治療的候選化合物。這些結(jié)果為進(jìn)一步生物學(xué)驗(yàn)證和研究提供了依據(jù)，也為今后MM的治療研究提供了新方向。本研究挖掘到一系列關(guān)鍵基因和與治療相關(guān)的候選化合物，但也存在部分局限，如基因數(shù)據(jù)庫僅選用了GEO數(shù)據(jù)庫，篩選到的差異表達(dá)基因偏少，未對候選化合物進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究，后續(xù)可做更深入的研究。