IRF6調(diào)控IFN-β的功能驗證與結(jié)構(gòu)研究

魏迪洋, 閆利明, 李巍然, 賈綺林

(1.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100081; 2.清華大學(xué) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室 教育部蛋白質(zhì)科學(xué)重點實驗室，北京 100084)

干擾素-β屬于I型干擾素，是由人成纖維細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有參與免疫調(diào)節(jié)、抑制病毒復(fù)制、抗寄生蟲、抗腫瘤等重要作用[1]。Kowalec等通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，揭示出使用干擾素-β療法治療多發(fā)性硬化時藥物介導(dǎo)的肝臟損傷(Drug-induced liver injury，DILI)的發(fā)生與干擾素調(diào)節(jié)因子6(Interferon regulatory factor 6, IRF6)基因的差異表達有關(guān)，從遺傳學(xué)的角度提示了IRF6基因及表達產(chǎn)物調(diào)控著干擾素-β介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[2]。IRF6是干擾素調(diào)節(jié)因子家族(IRFs)的重要成員，位于染色體1q32.2區(qū)域，表達產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子。該家族成員具有相似的N端結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合干擾素-β啟動子片段中的干擾素-β激活反應(yīng)元件(IFN-β-stimulated response element，ISRE)[1]。

近年來的研究顯示，IRF6的差異表達在多種臨床疾病中扮演著重要角色。IRF6調(diào)控著炎癥狀態(tài)下口腔黏膜角化上皮的炎癥細胞因子(包括IL-36γ[3]等)的分泌過程，并且其表達異常將削弱口腔黏膜對牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)及其他可疑致病菌的免疫屏障作用[4]。這揭示出IRF6基因及表達產(chǎn)物對機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控作用。IRF6在腫瘤的發(fā)生與抑制中也起著關(guān)鍵作用。Xu等[5]研究發(fā)現(xiàn)IRF6有望成為未分化型鼻咽癌靶向治療的突破點。Nobeyama等[6]發(fā)現(xiàn)，IRF6 5′端CpG雙核苷酸島的甲基化水平與黑色素瘤細胞對干擾素的反應(yīng)呈負相關(guān)。此外，IRF6參與外皮層(periderm)的形成，是口頜面發(fā)育，尤其是唇與腭部發(fā)育調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要成員[7]。非綜合征型唇腭裂(NSCL/P)是一類常見的先天畸形，是由遺傳因素和環(huán)境因素共同參與的復(fù)雜疾病。IRF6是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與NSCL/P最為相關(guān)的基因[8-9]，并已證實是范德伍德綜合征(Van der Woude syndrome, VWS)和腘翼狀胬肉綜合征(popliteal pterygium syndromes, PPS)的致病基因[10]。IRF6廣泛參與各種信號通路及生理生化過程，在RIPK4、p63[11]、Notch[12-13]、TGFβ[14-15]、TLR[16]等信號通路中均發(fā)揮著重要作用，與多種生物體生長發(fā)育相關(guān)基因如Msx1、PAX9、GRHL3等存在共表達等相互作用[17]，并參與細胞增殖、細胞周期、表皮發(fā)育、免疫應(yīng)答等過程的調(diào)控。

目前對IRF6調(diào)控干擾素-β相關(guān)的免疫通路尚無明確的分子生物學(xué)及功能驗證，并且IRF6蛋白的三維結(jié)構(gòu)研究仍為空白，而結(jié)構(gòu)生物學(xué)是揭示蛋白質(zhì)生理生化功能的重要手段和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用的大腸桿菌E.coliBL21，DH5α感受態(tài)細胞為北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；原核表達載體pET-28a為實驗室自備；限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI 為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR酶為北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的金牌mix；高純度質(zhì)粒小提試劑盒和快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；Ni-NTA親和層析介質(zhì)購自金斯瑞生物科技公司；離子交換HiTrap SP column購自美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI收錄IRF6基因的編碼區(qū)序列，由無錫青蘭公司進行IRF6基因的合成與原核表達的密碼子優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化序列由睿博興科公司合成引物。正向引物：5′-GGAATTCCATATGGCGTTACATCCTCG-3′；反向引物：5′-CCGCTCGAGTTAGCTGCCCGGGTTAAT-3′。

對N端1～386位堿基進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠(1%)回收目的片段，利用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI 對載體和基因片段進行酶切處理(5～6 h)。利用T4連接酶對載體和基因片段進行連接，16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～20 h。挑選單菌落接種5 mL的LB(Lysogeny Broth)液體培養(yǎng)基(卡納霉素抗性)，在37 ℃搖床中培養(yǎng)6～10 h，利用小量質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取，并送陽性克隆進行測序，核對分子構(gòu)建結(jié)果。

1.2.2 蛋白的檢測表達與純化

將測序陽性克隆用于轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～20 h；挑取單菌落，接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。將5 mL培養(yǎng)物接種到800 mL含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，預(yù)熱的37 ℃搖床培養(yǎng)OD600數(shù)值達到0.8(約4 h)。將培養(yǎng)物放入冰水混合物中降溫10 min，加入0.3 mL IPTG 誘導(dǎo)劑后轉(zhuǎn)移16 ℃的搖床培養(yǎng)12～17 h。4 500 r/min，離心10 min收集大腸桿菌，使用Lysis Buffer(20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，pH 8.0)重懸。重懸液中加入1 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF。用超高壓細胞破碎儀(聚能生物公司，JNBIO)進行細胞破碎，收集破碎后的菌液在冰水浴中置于超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份公司，SCIENTZ-IID)設(shè)置功率200 W，工作10 min。細胞碎片和上清液使用14 000 r/min離心40 min進行分離。將高速離心得到的上清液用于Ni2+-NTA親和柱純化。使用20 mmol/L的咪唑溶液充分洗凈親和柱上的殘留雜蛋白，500 mmol/L的咪唑溶液洗脫目的蛋白。

將洗脫后的蛋白樣品濃縮、降咪唑濃度后使用離子交換層析柱HiTrap SP column進一步純化。緩沖液A：20 mmol/L Tris；緩沖液B：20 mmol/L Tris；1 mol/L NaCl，pH值均為8.0。分布收集蛋白樣品，并使用SDS-PAGE檢測蛋白的純度。

1.2.3 蛋白核酸復(fù)合體組裝及晶體篩選

選擇IFN-β啟動子中長度為13 bp的一段堿基序列，于睿博興科公司合成其互補的兩條DNA單鏈，設(shè)置PCR程序(98 ℃變性10 min，之后從95 ℃起每次下降10 ℃，每個溫度維持12 s，最終降至25 ℃后以4 ℃、10 min結(jié)束)，可得到DNA雙鏈。兩條互補的DNA單鏈序列：AAAGTGAAAGTGA；TTCACTTTCACTT。

將過量的dsDNA與濃縮至15 mg/mL的IRF6 N端結(jié)構(gòu)域蛋白(以下簡稱IRF6 N1)混合后置于冰上孵育2 h后4 ℃高速離心10 min，除去沉淀，然后在16 ℃晶體室中使用懸滴氣相擴散法篩選晶體。使用Hampton Research公司相關(guān)結(jié)晶試劑(表1)。

表1 晶體篩選與優(yōu)化中使用的試劑盒

1.2.4 EMSA試驗驗證蛋白與核酸相互作用

通過EMSA試驗驗證IRF6 N1與IFN-β啟動子核酸的相互作用。制備體積分數(shù)為10%的Native膠，依照表2的成分加入EP管中，冰上孵育40 min后上樣，冰水浴電泳(7 mA、120 min)。結(jié)束后將膠放置到具有核酸染料的緩沖液中染色5 min，在紫外光下觀察條帶。

表2 EMSA中不同濃度配比的蛋白與核酸成分

2 結(jié)果

2.1 基因克隆和重組表達質(zhì)粒的鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)體積分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見在250～500 bp有特異性條帶(圖1)，大小與386 bp預(yù)期相符。

左側(cè)泳道為IRF6 N1核酸片段的擴增結(jié)果，對應(yīng)N端1～386位堿基，片段大小為386 bp；右側(cè)泳道為DNA Marker

將質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI 進行酶切，37 ℃水浴鍋中酶切30 min，1%瓊脂糖凝膠鑒定，可見約386 bp的目的基因片段。

將測序結(jié)果與載體和基因序列仔細核對，確認已將IRF6基因N端1～386位堿基克隆到了pET-28a載體上。

2.2 重組蛋白的純化

選擇20 mmol/L的咪唑濃度進行洗雜，500 mmol/L的咪唑濃度進行目的蛋白的洗脫。洗脫后的蛋白降咪唑濃度至100 mmol/L以下，以防止影響蛋白性質(zhì)。

將Ni親和柱洗脫的目的蛋白進行HiTrap SP column離子交換層析柱純化，紫外UV280的吸收圖譜如圖2(a)。根據(jù)出峰位置選取峰形對稱區(qū)域的蛋白，通過SDS-PAGE分析表明純化后的重組蛋白純度較高[圖2(b)]。

(a)IRF6 N1蛋白通過 HiTrap SP column離子交換層析柱純化紫外吸收圖譜；(b)純化后的IRF6 N1蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖，左側(cè)泳道為IRF6 N1蛋白，右側(cè)為蛋白Marker

2.3 蛋白-核酸復(fù)合體晶體生長

在組裝完成的蛋白-核酸復(fù)合體溶液中加入4 mmol/L的還原劑DTT后進行晶體生長篩選。最終優(yōu)化的晶體生長的池液條件為160 μL PEG/Ion 1 14號混合40 μL Index 54號。選擇顯微鏡下形態(tài)較佳的晶體進行進一步X射線衍射試驗與晶體解析(圖3)。

(a)經(jīng)過優(yōu)化的晶體照片；(b)晶體的衍射圖。分辨率達2.68?

2.4 蛋白-核酸相互作用的EMSA驗證

通過EMSA試驗，證明了IRF6 N1與IFN-β啟動子核酸確實具有較強的相互作用[圖4(a)]，可形成蛋白-核酸復(fù)合體，并且隨蛋白與核酸物質(zhì)的量配比變化結(jié)合能力隨之變化[圖4(b)]。不過EMSA無法準(zhǔn)確定量指示蛋白與核酸結(jié)合的配比，IRF6 N1與IFN-β啟動子核酸的具體作用方式仍需復(fù)合體結(jié)構(gòu)的解析來進一步揭示。

(a)左側(cè)泳道為空白核酸對照，右側(cè)泳道為加入了蛋白與核酸孵育后的結(jié)果，可見在泳道上方形成了明顯的蛋白-核酸復(fù)合體條帶；(b)將蛋白與核酸按照不同的物質(zhì)的量配比進行孵育后的EMSA結(jié)果，從左到右分別為1～7號泳道。相應(yīng)配比詳見表2

3 討論與結(jié)論

干擾素調(diào)節(jié)因子家族(IRFs)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在機體病毒感染后的干擾素調(diào)節(jié)通路及干擾素誘導(dǎo)基因的調(diào)控中起著十分重要的作用。該家族中已有IRF1[18]、IRF3[19-20]和IRF7[19]等解析出了與干擾素-β啟動子或增強子核酸形成的蛋白-核酸復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)，直接揭示了其對干擾素-β相關(guān)免疫調(diào)節(jié)通路的調(diào)控作用與作用方式。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示蛋白IRF6 N端是一段IRF超家族結(jié)構(gòu)域，即具有3個DNA結(jié)合位點(DNA-binding region)。該結(jié)合位點由5個進化保守的色氨酸重復(fù)序列構(gòu)成，因此也稱為“trytophan pentad repeat”[1]。據(jù)文獻報道該家族特征性的DNA結(jié)合位點可以與干擾素β啟動子元件中特定的片段結(jié)合，是一種α螺旋-轉(zhuǎn)角-α螺旋模體結(jié)構(gòu)(helix-turn-helix motif)。從保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果推測IRF6具有同家族其他成員類似的干擾素-β免疫調(diào)節(jié)通路的調(diào)控作用。研究顯示，IRF1可以與干擾素β啟動子中的positive regulatory domain I(PRD I)識別并形成復(fù)合體[18]，IRF3、IRF7可與PRD I和PRD III識別并與ATF-2/c-Jun共同形成蛋白-核酸復(fù)合體[19-20]。本研究通過EMSA試驗定性驗證了IRF6 N端結(jié)構(gòu)域與干擾素β啟動子元件的PRD I片段具有明確相互作用。該推測的證實將對IRF6在相關(guān)疾病的治療中干擾素藥物的應(yīng)用提供思路和依據(jù)。

通過將蛋白溶液與雙鏈DNA核酸片段孵育后結(jié)晶，多輪優(yōu)化后獲得了形態(tài)較佳的蛋白晶體，在初步的X射線衍射試驗中獲得了較好的衍射圖像，并獲得了2.68?的高分辨率數(shù)據(jù)。這將為獲得干擾素調(diào)節(jié)因子6蛋白N端結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)的解析提供幫助。初步的結(jié)構(gòu)解析結(jié)果顯示獲得的晶體為蛋白質(zhì)與核酸的復(fù)合物。蛋白-核酸復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)的揭示可以提供蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，為相關(guān)病理機制的解釋和免疫、基因療法的探索提供了重要研究基礎(chǔ)。

致謝：感謝合作單位清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室提供的專業(yè)指導(dǎo)與幫助。