不同種類的ZnO 納米顆粒對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞離子吸收的影響

王咪咪 吳明紅 王艷麗

(1.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 上海 200444; 2.上海大學(xué)納米化學(xué)與生物學(xué)研究所， 上海 200444;3.上海大學(xué)腫瘤精準(zhǔn)靶向研究中心， 上海 200444)

ZnO 納米顆粒(nanoparticles， NPs)因其獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及合成便利性， 使得市場(chǎng)上有許多基于ZnO NPs 的產(chǎn)品[1-3].例如， 生活中最常用的防曬霜和日常護(hù)理品[2]、食品添加劑、食品包裝和軟膏等[3].已有的關(guān)于ZnO NPs 對(duì)細(xì)胞以及生物毒性影響的研究結(jié)果表明， ZnO NPs 可直接損害肺系統(tǒng)， 隨后誘發(fā)彌漫性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征， 嚴(yán)重的甚至?xí)氯怂劳鯷4-6].Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)， 維生素C 可使ZnO NPs 的細(xì)胞毒性加強(qiáng).Go等[8]也研究了含有ZnO NPs 的復(fù)合體系對(duì)生物體的影響.

Fe3+， Ca2+和Mg2+作為維持動(dòng)物細(xì)胞活力的重要陽(yáng)離子， 是許多酶促反應(yīng)必不可少的輔助因子.它們能夠通過(guò)細(xì)胞膜上的離子通道進(jìn)入細(xì)胞， 影響細(xì)胞的生命活動(dòng)[9-12].人體內(nèi)缺鐵會(huì)造成缺鐵性貧血， 嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)心臟擴(kuò)大， 甚至心力衰竭等癥狀.鈣元素含量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、軟骨病等疾病.鎂元素含量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生高鎂血癥， 導(dǎo)致腎衰竭和甲狀腺功能減退等疾病.本工作以人胃黏膜上皮細(xì)胞(gastric epithelium cells-1， GES-1)為研究對(duì)象， 將5 種不同的ZnO NPs 設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)濃度， 并與GES-1 共同培養(yǎng)， 通過(guò)電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer， ICP-AES)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Fe3+，Ca2+和Mg2+的濃度， 以此來(lái)研究不同種類ZnO NPs 對(duì)離子吸收的影響.后續(xù)通過(guò)對(duì)細(xì)胞活性以及活性氧(reactive oxygen species， ROS)水平的檢測(cè)， 探究了ZnO NPs 影響離子吸收的機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

GES-1 細(xì)胞(上海美軒生物公司)， DMEM 培養(yǎng)基(上海賽戈生物科技有限公司)， 北美特級(jí)胎牛血清(上海熠晨生物科技有限公司)， 25% Typsin-EDTA(美國(guó)Invitrogen 公司)， ZnO NPs(杭州萬(wàn)景新材料有限公司、南京海泰納米材料公司)， 六水合三氯化鐵(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)， Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)， 活性氧水平檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所).

微量移液槍(0.5～20 μL， 20～200 μL， 100～1 000 μL， 德國(guó)Eppendorf 公司)， XDS-1B 倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)， YJ-875 型醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化有限公司)， Allegra X-15R 離心機(jī)(美國(guó)Beckman 公司)， MLS-3750 高壓滅菌鍋(日本三洋公司)，-80°C 超低溫冰箱(美國(guó)Thermo 公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 5 種ZnO NPs 的表征

本工作使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope， TEM)觀察ZnO NPs 的形貌， 同時(shí)使用動(dòng)態(tài)光散射儀(dynamic light scattering， DLS)和納米粒度及電位分析儀(ZataSizer 3000HSA)分析了ZnO NPs 樣品在液體中的粒徑和表面電勢(shì).

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

取生長(zhǎng)良好的GES-1， 將其培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)， 用移液槍將上清吸出.加入2 mL 胰酶消化3 min 后， 再加入新培養(yǎng)基終止消化.轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中， 1 200 r/min 離心3 min.去除上清， 加入適量的新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞.吸取一定量轉(zhuǎn)移至已加入新培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)， 于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).

1.2.3 ICP-AES 測(cè)定Fe3+， Ca2+， Mg2+和Zn2+的濃度

取生長(zhǎng)良好的GES-1 接種于6 孔板中， 待GES-1 鋪滿60%～70%時(shí)， 吸出培養(yǎng)基.重新加入2 mL 由不同種類的ZnO NPs(50 nm ZnO NPs(親水)， 50 nm ZnO NPs(親油)，100 nm ZnO NPs(親水)， 20 nm ZnO NPs(親水)， 20 nm ZnO NPs(親油))配成的不同質(zhì)量濃度(5， 10， 15 mg/L)的培養(yǎng)基， 同時(shí)每孔都含20 μmol/L Fe3+.每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)平行樣.設(shè)置只用培養(yǎng)基(不含ZnO NPs，僅含20 μmol/L Fe3+)培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，同樣設(shè)置3 個(gè)平行樣.恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后， 收集樣品， 并將收集到的細(xì)胞計(jì)數(shù).轉(zhuǎn)移到20 mL 的玻璃管中， 用王水進(jìn)行消解， 趕酸后用ICP-AES 測(cè)定溶液中Fe3+， Ca2+， Mg2+和Zn2+的濃度.

1.2.4 CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力

取生長(zhǎng)良好的GES-1 接種于96 孔板中， 待GES-1 鋪滿60%～70%時(shí)， 吸出培養(yǎng)基.重新加入100 μL 由不同種類的ZnO NPs 配成的不同質(zhì)量濃度(10， 15， 18， 20， 25， 30 mg/L)的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組.設(shè)置只用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組， 繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.加入含有10 %CCK-8 試劑盒試劑的新培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h， 然后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度.

1.2.5 LDH 法檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性

取生長(zhǎng)良好的GES-1 接種于96 孔板中， 待GES-1 鋪滿60%～70%時(shí)， 吸出培養(yǎng)基.重新加入100 μL 含1%胎牛血清的， 且由不同種類的ZnO NPs 配成的不同質(zhì)量濃度(5， 10，15 mg/L)的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組.設(shè)置只用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，每個(gè)樣本設(shè)置6 個(gè)平行樣，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.細(xì)胞最大酶活性對(duì)照組為加入10 μL LDH 釋放試劑培養(yǎng)1 h 的細(xì)胞.根據(jù)試劑盒的操作步驟處理樣本， 然后用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定吸光度.

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的測(cè)定

取生長(zhǎng)良好的GES-1 接種于96 孔板中， 待GES-1 鋪滿60%～70%時(shí)， 吸出培養(yǎng)基.重新加入由不同種類的ZnO NPs 配成的不同質(zhì)量濃度(5， 10， 15 mg/L)的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組.設(shè)置只用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組.培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后， 按照ROS 水平檢測(cè)試劑盒的操作步驟進(jìn)行樣本處理， 使用酶標(biāo)儀在525 nm 處測(cè)定吸光度.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組測(cè)得的數(shù)據(jù)比值就是細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的變化.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次， 每次設(shè)置3 個(gè)平行樣.

2 結(jié)果和討論

2.1 ZnO NPs 的表征

圖1 為不同種類的ZnO NPs 的TEM 照片.可以看到， ZnO NPs 呈現(xiàn)出的形態(tài)大小不均，大部分是不規(guī)則的球狀或棒狀形態(tài).王寧等[13]的研究發(fā)現(xiàn)， ZnO NPs 一旦進(jìn)入水環(huán)境， 會(huì)因?yàn)轭w粒間的相互作用而發(fā)生團(tuán)聚.從表1 也可以看出: 不論是在水中還是在培養(yǎng)基中， ZnO NPs 都容易發(fā)生團(tuán)聚; 與培養(yǎng)基相比， ZnO NPs 在水中的分散性更好; ZnO NPs 在培養(yǎng)基中的表面電勢(shì)約為-5 mV， 再次證明了ZnO NPs 在培養(yǎng)基中是不能穩(wěn)定存在的.

表1 ZnO NPs 在水中和在培養(yǎng)基中的水合粒徑以及表面電位Table 1 Hydrodynamic diameters and zata potential of ZnO NPs in culture medium and in water

圖1 5 種類型ZnO NPs 的TEM 圖片F(xiàn)ig.1 TEM images of the five types of ZnO NPs

2.2 ZnO NPs 及其復(fù)合體系對(duì)GES-1 活力的影響

采用CCK-8 試劑盒測(cè)定了不同種類的ZnO NPs 以及15 mg/L 100 nm ZnO NPs(親水)與不同濃度Fe3+組成的復(fù)合體系對(duì)GES-1 活力的影響， 結(jié)果如圖2 所示， 其中**P和*P表示與對(duì)照組相比的顯著性差異， **P ＜0.01， *P ＜0.05.

Reshma等[14]在探究不同質(zhì)量濃度的ZnO NPs 對(duì)人胚腎細(xì)胞的毒性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)ZnO NPs 的質(zhì)量濃度低于50 mg/L 時(shí)， 人胚腎細(xì)胞存活率約為80%.由圖2(a)～(e)可以看出:當(dāng)50 和100 nm ZnO NPs 的 質(zhì) 量 濃 度 為18 mg/L 時(shí)， GES-1 的 細(xì) 胞 活 力 顯 著 下 降; 當(dāng)20 nm ZnO NPs 的質(zhì)量濃度為18 mg/L 時(shí)， GES-1 的細(xì)胞活力為正常細(xì)胞的50%左右; 當(dāng)5 種類型的ZnO NPs 的質(zhì)量濃度為15 mg/L 時(shí)， GES-1 的細(xì)胞活力都表現(xiàn)得比較正常.

人體血液中的Fe3+濃度為10～30 μmol/L， 本工作選取15 mg/L 100 nm ZnO NPs(親水)與不同濃度Fe3+組成復(fù)合體系， 探究了Fe3+的實(shí)驗(yàn)濃度.由圖2(e)可知， 當(dāng)Fe3+濃度為10 和20 μmol/L 時(shí)， GES-1 的細(xì)胞活力均表現(xiàn)正常.為了防止Fe3+濃度過(guò)低， 樣本處理過(guò)程中誤差變大， 所以本工作選取20 μmol/L 作為Fe3+的實(shí)驗(yàn)濃度.

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)GES-1 活力的影響Fig.2 Viability of GES-1 after exposed to different culture medium

2.3 ZnO NPs 對(duì)細(xì)胞吸收Fe3+， Ca2+和Mg2+的影響

采用原子吸收光譜法檢測(cè)了不同種類的ZnO NPs 對(duì)細(xì)胞吸收Fe3+， Ca2+和Mg2+的影響， 結(jié)果如圖3 和4 所示， 其中**P和*P表示與對(duì)照組相比的顯著性差異， **P ＜0.01，*P ＜0.05.

Sembratowicz等[15]發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)時(shí)， 金納米顆粒會(huì)抑制Fe3+， Ca2+和K2+的吸收.Hara等[16]發(fā)現(xiàn)， 二果糖酐Ⅲ會(huì)促進(jìn)大鼠大腸中鐵的吸收.由圖3 可以看出: ZnO NPs 會(huì)增加細(xì)胞對(duì)Fe3+， Ca2+和Mg2+的吸收; 不同粒徑的ZnO NPs 對(duì)GES-1 離子吸收的影響不同， 其中50 nm ZnO NPs(親水)對(duì)離子吸收的影響最為顯著.加入50 nm ZnO NPs(親水)會(huì)使細(xì)胞對(duì)Fe3+和Mg2+的吸收更為敏感.當(dāng)培養(yǎng)基中含有5 mg/L 50 nm ZnO NPs(親水)時(shí)， 細(xì)胞對(duì)Fe3+和Mg2+的吸收相較對(duì)照組分別增加了28.4%和23.1%.隨著ZnO NPs 質(zhì)量濃度的升高， Fe3+， Ca2+和Mg2+在細(xì)胞內(nèi)的濃度逐漸增加， 當(dāng)ZnO NPs 的質(zhì)量濃度為15 mg/L 時(shí)，細(xì)胞離子吸收的濃度最高.當(dāng)用15 mg/L 50 nm ZnO NPs(親水)處理細(xì)胞時(shí)， 細(xì)胞對(duì)Fe3+，Ca2+和Mg2+的吸收相較對(duì)照組分別增加了271.8%， 173.7%和137.5%.由圖4 可以看出，ZnO NPs 的親水和親油特性對(duì)細(xì)胞離子吸收沒(méi)有顯著影響.

圖3 不同粒徑ZnO NPs 對(duì)離子吸收的影響Fig.3 Effects of ion absorption at different particle sizes of ZnO NPs

圖4 具有不同表面特性的ZnO NPs 對(duì)離子吸收的影響Fig.4 Effects of ion absorption at different surface properties of ZnO NPs

2.4 ZnO NPs 對(duì)細(xì)胞毒性的影響

Mortimer等[17]研究發(fā)現(xiàn)， ZnO NPs 對(duì)細(xì)胞的毒性與其溶解出的Zn2+有關(guān).本工作探究了GES-1 內(nèi)Fe3+， Ca2+和Mg2+的濃度變化與Zn2+濃度之間的關(guān)系， 結(jié)果如圖5 所示， 其中*P表示與對(duì)照組相比的顯著性差異， *P ＜0.05.

由圖5(a)可知: 相對(duì)于另外3 種納米顆粒， 經(jīng)50 nm ZnO NPs(親水)培養(yǎng)后， GES-1 內(nèi)的Zn2+濃度最高， 特別是10 和15 mg/L 50 nm ZnO NPs(親水)，Zn2+濃度相較于對(duì)照組分別增加了97.5%和283.9%.由此可以看出， GES-1 內(nèi)Zn2+濃度的升高， 在一定程度上會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)Fe3+， Ca2+和Mg2+的濃度.由圖5(c)可以看出， 在體外實(shí)驗(yàn)僅含有ZnO NPs 的培養(yǎng)基中， 50 nm ZnO NPs(親水)在15 mg/L 質(zhì)量濃度時(shí)溶出的Zn2+濃度最高.

圖5 在不同環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Zn2+含量對(duì)比Fig.5 Comparisons of Zn2+ content in experimental groups and control group in different environment

2.5 ZnO NPs 影響Fe3+， Ca2+和Mg2+吸收的機(jī)理探討

由于離子通道或特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的存在， 礦物質(zhì)可以通過(guò)簡(jiǎn)單的擴(kuò)散或主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞.Espinoza等[18]通過(guò)抑制二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和人體內(nèi)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 觀察到人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞對(duì)Fe， Gu 和Zn 的攝取減少.Salovaara等[19]研究了不同種類的有機(jī)酸對(duì)上皮細(xì)胞系中鐵離子吸收的影響， 觀察到酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸和富馬酸可以增強(qiáng)鐵離子的吸收， 并顯示離子吸收模式與有機(jī)酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān).本工作分別對(duì)經(jīng)ZnO NPs 處理過(guò)的GES-1 的細(xì)胞活力、細(xì)胞膜損傷程度和細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平進(jìn)行了檢測(cè)， 來(lái)探究ZnO NPs 影響GES-1 內(nèi)Fe3+，Ca2+和Mg2+吸收的過(guò)程， 結(jié)果如圖6 所示， 其中**P和*P表示與對(duì)照組相比的顯著性差異，**P ＜0.01， *P ＜0.05.

由圖6(a)可以看出: 15 mg/L 50 nm ZnO NPs 會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性， 相較對(duì)照組活力降低了62.7%; 另外3 種ZnO NPs 在此質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響.由圖6(b)可以看出:當(dāng)質(zhì)量濃度為15 mg/L 時(shí)， ZnO NPs 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜不同程度的損傷.由圖6(c)可以看出:當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/L 時(shí)， ZnO NPs 會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平; 當(dāng)質(zhì)量濃度為15 mg/L 時(shí)，GES-1 內(nèi)ROS 水平明顯升高， 其中經(jīng)20 nm(親水)， 20 nm(親油)， 50 nm 和100 nm 處理過(guò)的細(xì)胞分別升高了25.45%， 29.75%， 99.4%， 41.8%.根據(jù)圖6 的結(jié)果可知: 在低質(zhì)量濃度時(shí)， ZnO NPs 對(duì)GES-1 沒(méi)有明顯毒性， 但會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平升高， 甚至造成細(xì)胞膜的輕微損傷， 從而影響細(xì)胞對(duì)Fe3+， Ca2+和Mg2+的吸收.

圖6 不同質(zhì)量濃度的ZnO NPs 培養(yǎng)24 h 對(duì)GES-1 的影響Fig.6 Effects of different concentrations of ZnO NPs on GES-1 cultured for 24 h

3 結(jié)束語(yǔ)

本工作將不同種類的ZnO NPs 與GES-1 共同培養(yǎng)24 h， 觀察細(xì)胞吸收Fe3+， Ca2+和Mg2+的濃度變化， 為納米顆粒對(duì)細(xì)胞離子吸收的影響提供理論依據(jù).研究結(jié)果表明: 當(dāng)ZnO NPs 的質(zhì)量濃度較低時(shí)， 會(huì)導(dǎo)致GES-1 內(nèi)Fe3+， Ca2+和Mg2+濃度升高; 細(xì)胞內(nèi)離子吸收與ZnO NPs 的粒徑和質(zhì)量濃度有關(guān)， 50 nm ZnO NPs 在質(zhì)量濃度為15 mg/L 時(shí)對(duì)離子吸收的影響最為明顯， 細(xì)胞內(nèi)Zn2+質(zhì)量濃度的增加是導(dǎo)致離子吸收穩(wěn)態(tài)失衡的原因之一; 當(dāng)ZnO NPs 的質(zhì)量濃度較低時(shí)， 細(xì)胞活力雖然正常， 但細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平會(huì)上升且細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷，所以也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子濃度的升高.