銫-137γ射線輻射對郁金香鱗莖的誘變效應(yīng)

黑銀秀，劉君，郭方其，江景勇

（1.臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臺州 3170002；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝所，浙江 杭州 310021）

郁金香Tulipa gesneriana是百合科Liliaceae郁金香屬Tulipa多年生鱗莖植物，是世界著名的球根花卉。近年來，國內(nèi)的一些植物園和花海展區(qū)從荷蘭進口的郁金香商品種球的品種和數(shù)量在逐年增多[1-3]，種球嚴(yán)重依賴國外進口。輻射誘變育種具有變異頻率高、變異幅度大、育種周期短等特點，是當(dāng)前無性繁殖植物育種的主要方法之一。全世界采用該技術(shù)已在營養(yǎng)繁殖植物中育出465個突變品種，其中，大多數(shù)是花卉植物，包括菊花Chrysanthemum × morifolium、大麗花Dahlia pinnata、玫瑰Rosa rugosa等[4]。γ射線輻射誘變技術(shù)在我國花卉育種中已取得顯著成果，菊花[5-6]、月季的誘變新品種在所有觀賞植物中首屈一指[7]。另外，水仙Narcissus tazettavar.chinensis.[8]、唐菖蒲Gladiolus hybridus[9-10]、蓮Nelumbo nucifera[11]、香雪蘭Freesia refracta、王百合Lilium regale[12]等多種花卉經(jīng)輻射后均獲得了突變品種。早在上個世紀(jì)80年代，荷蘭De Mol等首先進行了郁金香輻射育種研究[13]，許多受歡迎的郁金香品種，如‘Murillo’‘William c opland’‘Bartigon’等就是通過突變的方法選育出來的[14]。近十余年來，國內(nèi)關(guān)于郁金香的研究主要集中在郁金香的引種與栽培[15-16]、低溫處理與花期調(diào)控[17-18]、鱗莖發(fā)育和再利用[19-20]、雜交育種[21-22]等方面。為研究輻射對郁金香鱗莖的誘變效應(yīng)，本研究以郁金香鱗莖為供試材料，探討了銫-137γ射線不同輻射劑量對鱗莖的花芽分化、出苗率、蕾期及開花性狀的影響，確定了輻射的半致死劑量，以期為郁金香輻射誘變育種適宜劑量的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

2018年6月至2019年4月，在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所進行輻射處理，在臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院基地進行栽培和結(jié)果調(diào)查。

1.2 試驗方法

本文在前期預(yù)試驗中用銫-137γ射線40 ～100 Gy進行郁金香花芽分化期輻射試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有經(jīng)輻射處理的種球在冷藏期鱗莖根盤均沒有突起跡象，播種1周后沒有發(fā)根，播種2周后芽仍未出土，后期鱗莖全部腐爛死亡，而對照（無輻射處理）的生根、出苗、開花則表現(xiàn)正常，說明40 G y已經(jīng)遠遠超過了郁金香花芽分化期鱗莖的致死劑量。因此，本次試驗選擇5～30 Gy進行試驗。

供試郁金香鱗莖于2018年3月在臺州市黃巖區(qū)藍美莊園基地收獲；試驗品種有‘紅牌’‘Red Label’、‘楊范內(nèi)斯’‘Jan van nes’、‘白雪公主’‘Royal virgin’；鱗莖大?。褐軓酱笥?0 cm；輻射時期：2018年6月5日（花芽分化前）；輻射源：銫-137(137Cs) γ射線；劑量率：1 Gy·min-1。試驗每個品種設(shè)置5個處理：0 Gy(CK)、5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)鱗莖數(shù)量為100個。

1.3 鱗莖儲藏方法

2018年4-8月，控制儲藏室溫度不高于22℃、相對濕度在65%±2%；9-11月，溫度為5±0.5℃。6月5日進行輻射處理，輻射處理后，種球仍放回儲藏室，每月取樣1次，每次每個處理取樣3個鱗莖進行解剖。

1.4 田間栽培方法

于2018年12月1日低溫處理完成后，挑選無病蟲害的鱗莖，種植于溫室中，調(diào)查統(tǒng)計輻射后各處理鱗莖的生根、出芽及開花情況。

1.5 指標(biāo)測定方法

芽長：將鱗莖外層鱗片剝掉，露出中心芽體，用游標(biāo)卡尺測量中心芽體的長，取平均值。

鱗莖生長點切片方法：將鱗莖外層鱗片剝掉，露出中心芽體，對生長點進行切片，在立體顯微鏡下觀察花芽的分化情況并拍照。

田間地栽試驗采用計數(shù)法和直尺測量法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射對郁金香鱗莖中心芽體生長的影響

由圖 1表明，‘紅牌’ 和‘楊范內(nèi)斯’兩個品種的鱗莖經(jīng)輻射處理后其中心芽的生長均受到抑制，生長變緩。隨著鱗莖儲藏時間的延長，中心芽逐漸伸長；隨著輻射劑量的增大，中心芽的芽長越小，被抑制作用越明顯。兩個品種不同輻射處理鱗莖中心芽的生長趨勢相同。由圖2可看出，和CK相比，5～30 Gy輻射處理明顯抑制郁金香鱗莖中心芽的生長，輻射劑量越大，抑制作用越明顯。

圖1 輻射對中心芽生長的影響Figure 1 Effect of radiation on the growth of central buds of different cultivars

2.2 輻射對郁金香花芽分化的影響

2.2.1 輻射對‘紅牌’花芽分化的影響 輻射后5個月對‘紅牌’中心芽體切片進行觀察，結(jié)果見圖 3。由圖3 可知，CK的花器官結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，可明顯看到3個外輪花瓣、3個內(nèi)輪花瓣、6個雄蕊及三棱形的雌蕊，且每個花藥具4個花粉囊，花粉囊呈圓形且明顯鼓起。花藥橫截面面積越來越大，截止到11月29日花藥的橫截面面積與柱頭橫截面面積接近。說明CK的花芽分化整個階段已經(jīng)完成。10 Gy、20 Gy、30 Gy處理花芽分化速度遲緩，花藥還未形成明顯的4個花粉囊，且單個花藥的橫截面面積明顯小于柱頭的橫截面面積。其中，5 Gy處理花瓣結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，雄蕊雖然有6個花藥，但其中兩個花藥僅有2個花粉囊（圖3A）。20 G y處理花芽分化進度遲緩，6個雄蕊的花藥四角開始突起（圖3C），未分化為花粉囊，推斷該處理的花芽分化停止在雄蕊分化期。和CK相比，30 Gy處理雄蕊缺少一個，分化停滯在腎形階段，花瓣數(shù)目為5個，雌蕊畸形未形成三棱形（圖3D）。

2.2.2 輻射對‘楊范內(nèi)斯’花芽分化的影響 8月1日對‘楊范內(nèi)斯’鱗莖進行切片拍照觀察，發(fā)現(xiàn)此時CK已經(jīng)完成整個花芽分化進程（圖4A，圖4B），和‘紅牌’CK的形態(tài)相似。

圖2 不同輻射劑量對郁金香鱗莖中心芽長的影響Figure 2 Effect of different radiation dose on length of central bud of ‘Red Label’

由圖4可以看出，5 Gy處理的鱗莖花芽分化整個階段已經(jīng)完成，出現(xiàn)花藥個別花粉囊缺失（圖4C），柱頭四棱柱等現(xiàn)象（圖4D）。10 Gy處理的鱗莖柱頭呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，雄蕊畸形，花粉囊缺失較多（圖4E）。20 Gy處理的鱗莖花芽分化進度遲緩，雄蕊與雌蕊未完全分開，6個雄蕊呈現(xiàn)橢圓形或者腎形，未形成 4個花粉囊，花瓣呈短粗狀停滯分化。推斷20 Gy處理的花芽形態(tài)分化停滯在花瓣分化期（圖4F）。30 Gy處理的鱗莖花芽分化嚴(yán)重遲緩，花瓣形態(tài)短粗、結(jié)構(gòu)不完整，雄蕊呈現(xiàn)腎形、未形成4個花粉囊（圖4G），從縱切面可以看到生長錐的基部周圍有幾個雄蕊原基小突起（圖4H）。推斷30 Gy處理的鱗莖花芽形態(tài)分化在花瓣分化期已經(jīng)停滯。

圖3 輻射對‘紅牌’花芽分化的影響Figure 3 Effect of radiation on flower bud differentiation of ‘Red Label’

圖4 輻射對‘楊范內(nèi)斯’花芽分化的影響Figure 4 Effect of different radiation dose on flower bud differentiation of ‘Jan van nes’

2.3 輻射對郁金香鱗莖出苗率的影響

由表1表明，隨著輻射劑量的增大，3個品種的出苗率均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，輻射劑量越高，死亡率越高。不同品種對輻射的敏感度不同，其中，‘白雪公主’對銫-137γ射線的輻射較敏感，輻射劑量為10 Gy時，出苗率只有2.67%；‘紅牌’耐輻射的能力最強，5 Gy處理出苗率仍高達91.45%。

表1 輻射對不同郁金香品種出苗率的影響Table 1 Effect of different radiation dose on the emergence rate of different cultivars of tulip

3個品種鱗莖經(jīng)5 Gy輻射處理后的出苗率均在60%以上，而10 Gy處理的出苗率均降至30%以下。說明，對3個品種花芽分化期的鱗莖進行輻射誘導(dǎo)，半致死劑量在5～10 Gy之間。

2.4 輻射對郁金香蕾期的影響

‘紅牌’鱗莖5 Gy輻射處理，蕾期花瓣邊緣出現(xiàn)明顯裂刻，葉片邊緣開裂（圖5A）；10 Gy處理，蕾期植株矮小、葉片開裂、花葶不抽出（圖5B）。‘楊范內(nèi)斯’鱗莖10 Gy處理，蕾期植株矮縮，花葶不抽出，葉片變窄、細長或畸形（圖5C）；10 Gy處理，蕾期植株矮小、葉片變窄、花瓣和花絲缺失、柱頭畸形（圖5D）。

2.5 輻射對郁金香開花性狀的影響

‘紅牌’鱗莖經(jīng)5 Gy處理的開花率達到80%，已開花植株花瓣全部出現(xiàn)不同程度的裂刻；經(jīng)10 Gy處理的花瓣裂刻加深，花瓣顏色不均勻（圖6）。由圖7可以看出，和CK（I）相比，‘白雪公主’鱗莖經(jīng)5 Gy輻射之后的開花性狀產(chǎn)生明顯變異。主要變化為：有的植株花瓣出現(xiàn)紅色條紋（B、C、D）、有的半個花瓣變?yōu)榧t色（A），雄蕊由正常的6個變?yōu)?或者更多（E、G、H），雌蕊由正常的三棱柱變?yōu)?開裂（G）、5開裂（E）或不規(guī)則畸形（F），花瓣上有殘留的雄蕊（F）、花瓣邊緣出現(xiàn)深淺不一的開裂（F、G、H）。

圖5 輻射對郁金香蕾期的影響Figure 5 Effect of different radiation dose on flower bud stage of‘Red Label’ and ‘Jan van nes’

圖6 輻射對‘紅牌’開花性狀的影響Figure 6 Effect of different radiation dose on flowering traits of ‘Red Label’

圖7 5 Gy輻射對‘白雪公主’開花性狀的影響Figure 7 Effect of 5 Gy radiation on flowering traits of ‘Royal virgin’

3 結(jié)論

本研究對不同輻射劑量處理郁金香鱗莖進行切片，觀察輻射對其花芽分化形態(tài)的影響，并進行田間栽培，在苗期、蕾期、花期進行了形態(tài)學(xué)觀察。不同劑量的輻射處理對郁金香不同時期的影響程度也不相同，發(fā)生顯著性變異的較多。試驗結(jié)果表明，大于5 Gy輻射處理能顯著抑制鱗莖中心芽的生長，且輻射劑量越大，抑制作用越明顯。儲藏期間對中心芽體進行切片觀察發(fā)現(xiàn)，輻射劑量越大，花芽分化受到的影響越大、分化進度越慢。和CK相比，5 Gy處理的鱗莖已完成花芽分化且花結(jié)構(gòu)基本完整，10～30 Gy輻射處理的出現(xiàn)了花芽分化停滯、花瓣短粗或停滯分化、雄蕊為分化早期的腎形、花藥四角剛開始凸起、花粉囊缺失、柱頭呈現(xiàn)四棱形或者畸形等不同突變狀態(tài)。

在輻射育種中選擇適宜劑量和劑量率是提高誘變效率的重要因素[23]。由本試驗苗期觀察發(fā)現(xiàn)，‘白雪公主’對銫-137γ射線的輻射較敏感，而‘紅牌’耐輻射的能力相對較強。隨著0～30 Gy輻射劑量的增大，不同品種均呈現(xiàn)輻射劑量越高，死亡率越高，出苗率越低。20 Gy和30 Gy處理的出苗率為0%。3個品種50%的出苗率均發(fā)生在處理5～10 Gy之間，由此可初步推斷花芽分化期郁金香的輻射半致死劑量在5～10 Gy。由蕾期和花期的調(diào)查結(jié)果表明，輻射劑量越大變異效應(yīng)越顯著，其主要變異有植株矮小、長勢緩慢、葉片開裂或畸形、花瓣變異或缺失、花葶不抽出、雌蕊和雄蕊缺失增多或畸形等。5 Gy處理的花瓣邊緣出現(xiàn)不同程度的裂刻，是篩選變異品種的合適劑量。

4 討論

張繼娜[24]和汪曉謙[25]將郁金香的花芽分化分為未分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期，其中，在雌蕊分化期可明顯看到在花芽原基的頂端形成三棱形的雌蕊[26]，據(jù)此推斷出本研究中CK和5 Gy處理的鱗莖已完成花芽分化的整個階段，而10～30 Gy處理的鱗莖花芽分化進度緩慢甚至停滯。

輻射誘變育種是利用γ射線等誘發(fā)植物基因和染色體畸變，獲得有價值的突變體，從而育成優(yōu)良品種[27]。本研究中，5 Gy處理的鱗莖出苗率在50%以上，能夠完成花芽分化進程，且開花性狀產(chǎn)生了一些變異，比如花瓣邊緣出現(xiàn)裂刻、花色變異等，說明5 Gy處理有利于得到更多的花部變異，是篩選變異品種的合適劑量。前人對百合L.brownievar.viridulum鱗莖進行輻射，從不定芽植株的突變率考慮，輻射誘發(fā)變異的適合劑量是1～3 Gy[28]。該劑量和本研究結(jié)果比較接近，百合和與郁金香同屬一科，可見他們對輻射劑量的敏感度也比較接近。

輻射誘變育種中常用的γ射線輻射源是鈷-60、銫-137及核反應(yīng)推[23]?；ɑ苎芯恐欣免?60γ射線的較多，而選用銫-137γ射線的極少。本文研究結(jié)果表明銫-137γ射線同樣可以達到輻射變異效果。需要注意的事項是，植物組織器官發(fā)育階段和生理狀態(tài)不同，對輻射的敏感性存在很大的差異[23]，因此，本文選擇花芽分化前且周徑大于10 cm的鱗莖進行輻射，這樣可以保證當(dāng)年觀測到花部的輻射效果。