巴西人參組培快繁體系的建立*

蔣華

(廣西壯族自治區(qū)國有維都林場雅江分場，廣西 來賓 546100)

巴西人參(Pfaffiapaniculate)，又稱琺菲亞，為莧科(Amaranthaceae)無柱莧屬(PfaffiaMart.)多年生草本植物[1]，主要分布于南美洲巴西等國的熱帶雨林地區(qū)，生長在陽光較為充足的地方，目前已在廣西、四川、浙江等地引種成功[2]。其根可入藥，富含多種礦物質(zhì)、氨基酸、維生素和皂苷成分，有降血糖、抗腫瘤、緩解疲勞、增強免疫力和治療風濕性關(guān)節(jié)炎等功效[3-4]。因其療效廣泛，國內(nèi)外對于巴西人參的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)備受關(guān)注，研制的多種藥食兩用的產(chǎn)品已投放市場[5-6]，廣受歡迎，經(jīng)濟效益與市場前景極為廣闊。然而，由于國際市場的超強度開發(fā)，巴西人參野生資源日益減少，已很難滿足市場需求；此外，巴西人參結(jié)實較少，種子發(fā)芽率極低，嚴重限制其開發(fā)進程。因此，解決資源緊缺問題已成為巴西人參研究的主要目標和首要任務(wù)[7]。

藥用植物組織培養(yǎng)與快速繁殖，不僅能夠克服種子繁殖中存在的諸多問題，還能夠改善常規(guī)繁殖速度慢、繁殖率低的缺點，且不受季節(jié)、氣候等因素的影響，具有速度快、質(zhì)量高、便于集約管理的優(yōu)點，可在較短時間內(nèi)獲得大量遺傳性狀一致的植株，供大規(guī)模規(guī)范化種植。目前，國內(nèi)外對巴西人參的研究多集中在化學及藥理作用方面，有關(guān)巴西人參種子萌發(fā)、苗木生產(chǎn)和栽培等繁殖培育方面的報道相對較少，嚴重制約了其規(guī)?；a(chǎn)[8]。國內(nèi)外在組織培養(yǎng)育苗方面的研究甚少，僅僅研究了莖段類型和容器大小[9]，N和P濃度[10]，蔗糖[11]、CO[12-13]等不同碳源等對巴西人參離體繁育的影響，多數(shù)直接選用MS作為培養(yǎng)基，未見對組織培養(yǎng)中各因素系統(tǒng)篩選的報道。國內(nèi)有關(guān)研究中，凌征柱等[14]和劉園[15]研究所得配方育苗周期相對較長，增殖系數(shù)較低，僅為3.22～3.92；許鴻源等[16]加靈發(fā)素進行組培雖然可提高育苗效率，但靈發(fā)素為其實驗室制備得來，并非市售藥品，藥品難得，成本較高，并不適于大規(guī)模組培工廠化育苗。因此，本研究以巴西人參莖段作為外植體材料，通過對初代誘導培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽等技術(shù)環(huán)節(jié)的影響因素進行系統(tǒng)研究，以期克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，建立一套育苗周期短、成活率高、苗木質(zhì)量好、成本較低的適于工廠化生產(chǎn)的巴西人參組培快繁技術(shù)體系，為開發(fā)和利用巴西人參以及豐富我國藥用植物資源種類，緩解國內(nèi)外市場種苗稀缺的狀況提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以巴西人參帶芽莖段為外植體材料，采自廣西壯族自治區(qū)國有維都林場雅江分場苗圃。

1.2 外植體消毒與初代芽誘導

于3—5月連續(xù)3個晴天的上午，剪取健壯巴西人參植株帶腋芽莖段，去除葉片，于0.5%洗潔精溶液中浸泡5 min，用自來水沖洗2～3 h，置于超凈工作臺上切成1.5～2.5 cm的莖段，于75%酒精中浸泡30 s后轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗5～6遍。將滅菌處理過的外植體分別接種在MS、WPM、B5、N6、Nitsch和White 6種培養(yǎng)基上，附加預試驗篩選的較優(yōu)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合(6-BA 0.4 mg/L和NAA 0.4 mg/L)，進行初代芽誘導培養(yǎng)，每個處理20瓶，每瓶接種1個莖段，重復3次，培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計初代芽誘導率、每一莖段平均萌芽個數(shù)及芽高。

1.3 繼代增殖培養(yǎng)

選擇生長較好且長勢一致的初代芽，以1.2實驗篩選的最佳培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度和配比的6-BA(0、1、2 mg/L)、2-IP(0、1、2 mg/L)、IBA(0、0.2、0.4 mg/L)和NAA(0、0.2、0.4 mg/L)進行增殖培養(yǎng)，上述試驗采用L9(34)設(shè)計正交試驗，從中選取最優(yōu)組合，然后以最優(yōu)組合為培養(yǎng)基配方，分別采用直插(單芽直立插入)和平鋪(單芽剪取節(jié)的位置水平接種)兩種方式接種，分別培養(yǎng)不同日期后觀察統(tǒng)計繼代芽增殖系數(shù)，每個處理10瓶，每瓶接種3個芽，重復3次。

1.4 生根培養(yǎng)

剪取高度≥2 cm的芽苗，以1/2WPM、2/3WPM、WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的生長激素6-BA(0、0.3、0.6 mg/L)、NAA(0.1、0.5、1.0 mg/L)和多效唑PP333(0、200、400 mg/L)進行生根培養(yǎng)。上述試驗采用L9(34)正交設(shè)計進行試驗，每個處理10瓶，每瓶接種3個芽，重復3次，統(tǒng)計生根時間、培養(yǎng)30 d后生根率、生根條數(shù)和根系狀況。

1.5 煉苗移栽

將根長約1 cm的組培苗，轉(zhuǎn)移到室外自然光下煉苗5 d，然后用清水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至經(jīng)過0.1%高錳酸鉀(KMnO4)消毒過的基質(zhì)中。移栽基質(zhì)為：(1)河沙；(2)紅心土；(3)椰糠︰谷殼=4︰1(v/v)；(4)營養(yǎng)土︰蛭石=2︰1(v/v)。每種基質(zhì)移栽50株，重復3次，30 d后統(tǒng)計成活率。

1.6 培養(yǎng)基配制消毒及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基配制消毒 以上各培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，瓊脂4 g/L，pH 5.8～6.2，配制分裝后在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

培養(yǎng)條件 溫度(25±3) ℃，光照時間12～14 h/d，光照強度1 500～2 500 lx。

1.7 數(shù)據(jù)處理

誘導率(%)=(萌芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

增殖系數(shù)=芽生長到可供切割芽數(shù)/接種時單芽總數(shù)；

生根率(%)=(生根芽數(shù)/接種總芽數(shù))×100%；

成活率(%)=(成活苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100%。

采用EXCEL 2016對試驗數(shù)據(jù)進行常規(guī)統(tǒng)計和作圖，SPSS 19.0進行方差分析和多重比較(鄧肯氏新復極差法)，顯著性水平均設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代誘導培養(yǎng)

巴西人參帶芽莖段外植體(圖1A)滅菌處理后進行初代誘導培養(yǎng)，6種不同基本培養(yǎng)基對初代芽誘導的影響見表1?？梢钥闯?，不同培養(yǎng)基對巴西人參初代誘導效果差異顯著。在誘導率方面，效果較好的是WPM和MS培養(yǎng)基，初代芽誘導率分別為90.65%和82.61%，兩者間差異不顯著；最差的是N6培養(yǎng)基，初代芽誘導率僅為13.56%。在萌芽數(shù)方面，WPM培養(yǎng)基顯著多于其他5種培養(yǎng)基，其他5種培養(yǎng)基間差異不明顯。在芽高方面，效果最好的是WPM培養(yǎng)基，較差的是N6、Nitsh和White培養(yǎng)基。因此，以WPM作為巴西人參基本培養(yǎng)基進行初代誘導培養(yǎng)效果最佳(圖1B)，誘導率達90.65%，平均萌芽數(shù)為2.90個，平均芽高2.70 cm。

圖1 巴西人參組織培養(yǎng)與快速繁殖注：A為滅菌外植體；B為初代誘導培養(yǎng)；C為繼代增殖培養(yǎng)；D為生根培養(yǎng)；E為生根培養(yǎng)；F為移栽成活組培苗。Fig.1 The tissue culture and rapid propagation of P.paniculate

表1 基本培養(yǎng)基對初代芽誘導的影響Tab.1 Effect of basic medium on initial bud induction

2.2 繼代增殖培養(yǎng)

2.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對繼代芽增殖的影響

選擇高約1.5 cm的初代芽，直立插入到9種不同的繼代增殖培養(yǎng)基上(基本培養(yǎng)基為WPM)，培養(yǎng)25 d觀察增殖效果(表2)。由表2可知，不同培養(yǎng)基增殖系數(shù)和芽高差異顯著。其中B7增殖系數(shù)最高，為4.58；B3芽高最高，為2.97 cm。對正交試驗結(jié)果進行極差分析(表3)，結(jié)果顯示，在增殖系數(shù)方面，各因素的極差分別為：R6-BA=1.53，R2-IP=0.24，RIBA=0.40，RNAA=0.42，顯示各因素影響作用的主次順序為：6-BA、NAA、IBA、2-IP，增殖系數(shù)最優(yōu)的組合應(yīng)為：6-BA 2.0 mg/L+2-IP 0 mg/L+IBA 0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；在芽高方面，各因素的極差分別為R6-BA=0.06，R2-IP=0.65，RIBA=0.50，RNAA=0.50，即因素影響作用的主次順序為：2-IP、IBA或NAA、6-BA，芽高最優(yōu)的組合應(yīng)為6-BA 2.0 mg/L+2-IP 0 mg/L+IBA 0.4 mg/L+NAA 0 mg/L。綜合分析，繼代增殖培養(yǎng)基應(yīng)該以增殖系數(shù)為主要參考指標，芽高為次要指標，最終優(yōu)選的巴西人參增殖培養(yǎng)的最佳生長調(diào)節(jié)劑處理為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，采用此組合進行巴西人參繼代增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)高，苗木生長健壯(圖1C)。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對繼代芽增殖的影響Tab.2 Effects of plant growth regulators on subculture bud multiplication

表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對繼代芽增殖影響的極差分析Tab.3 Range analysis of the effect of plant growth regulators on the proliferation of subculture buds

2.2.2 接種方式對繼代芽增殖的影響

分別采用單芽直插和單芽平鋪2種接種方式，培養(yǎng)15、30和45 d后觀察繼代芽生長情況，結(jié)果見圖2。

圖2 不同接種方式對繼代芽增殖的影響Fig.2 Effects of different inoculation mode on the proliferation of subculture buds

由圖2可知，在相同培養(yǎng)時間時，采用平鋪接種的方式其增殖系數(shù)明顯高于直插接種。采用直插方式接種，隨著生長時間的延長增殖系數(shù)逐漸升高，培養(yǎng)35 d增殖系數(shù)最高為5.16，顯著高于采用直插方式接種的其他培養(yǎng)時間；采用平鋪方式接種，隨著培養(yǎng)時間的增加，增殖系數(shù)逐漸增加，25 d增殖系數(shù)達5.21，之后增殖系數(shù)升高不顯著。因此，綜合考慮增殖系數(shù)和成本，巴西人參適宜繼代增殖的培養(yǎng)方式為以單芽平鋪的方式接種，選擇25 d作為繼代周期最佳。

2.3 生根培養(yǎng)

采用正交試驗研究不同基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑配比對巴西人參生根的影響，結(jié)果見表4。不同的培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑配比對巴西人參生根率、生根數(shù)和生根時間的影響差異顯著。通過對正交試驗結(jié)果進行極差分析(表5)可知，在生根率方面，各因素的極差分別為R基本培養(yǎng)基=9.12、R6-BA=38.6、RNAA=21.52、RPP333=2.36，即因素影響作用的主次順序為6-BA、NAA、基本培養(yǎng)基、PP333，巴西人參生根率最高的培養(yǎng)基組合是1/2WPM+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+PP333 200 mg/L；在根條數(shù)方面，各因素的極差分別為R基本培養(yǎng)基=1.49、R6-BA=8.63、RNAA=1.96、RPP333=1.81，即因素影響作用的主次順序為6-BA、NAA、基本培養(yǎng)基、PP333，巴西人參生根條數(shù)最多的培養(yǎng)基組合是1/2WPM+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+PP333 200 mg/L；在生根時間方面，各因素的極差分別為R基本培養(yǎng)基=3.66、R6-BA=3.28、RNAA=2.34、RPP333=0.83，即因素影響作用的主次順序為基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、PP333，巴西人參生根時間最短的培養(yǎng)及組合是1/2WPM+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+PP333 200 mg/L。其中，用生根率和生根條數(shù)這兩個指標優(yōu)選的培養(yǎng)基組合一致，而這兩個因素也是評價生根效果最重要的因素，因此，確定巴西人參生根誘導最佳的培養(yǎng)基組合為1/2WPM+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+PP333 200 mg/L。采用此種培養(yǎng)基生根率高，根條數(shù)多，根系狀況佳，生根效果見圖1D和圖1E。

表4 培養(yǎng)基配比對生根的影響Tab.4 Effects of medium combinations on rooting

表5 培養(yǎng)基配比對巴西人參生根影響的極差分析Tab.5 Range analysis of effects of different medium combinations on rooting of P.paniculate

2.4 煉苗移栽

將根系狀況良好的巴西人參組培苗經(jīng)過煉苗，移栽至4種不同基質(zhì)中，移栽30d后統(tǒng)計成活率，見圖3。

圖3 不同基質(zhì)對移栽成活率的影響Fig.3 Effect of different substrates on the survival rate of transplanting

由圖3可知，不同基質(zhì)對移栽成活率影響差異顯著，其中椰糠︰谷殼=4︰1移栽成活率最高，為98.67%，生長狀況良好(圖1F)，其次是營養(yǎng)土︰蛭石=2︰1，成活率為91.33%，但二者差別不大，最差的是河沙，成活率為68.00%。因此，綜合成本和成活率，移栽巴西人參最好選擇椰糠︰谷殼=4︰1作為移栽基質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

基本培養(yǎng)基直接關(guān)系植物的生長和發(fā)育[17]，不同植物在組織培養(yǎng)的不同階段所需的營養(yǎng)物質(zhì)不同，培養(yǎng)基作為營養(yǎng)來源，可為植物的生長提供充足的營養(yǎng)，但不同種類的培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分差異較大。MS培養(yǎng)基是應(yīng)用范圍最廣的、各種元素齊全的高鹽離子濃度培養(yǎng)基，尤其是NH4+和NO3-的濃度比較高，但MS也會因其高鹽離子濃度對某些植物的生長產(chǎn)生一定的抑制作用[18]；WPM因其含有較低濃度的無機鹽離子，廣泛用于植物組培快繁。白宇清等[19]研究毛錦杜鵑(Rhododendronmoumainense)莖段組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)WPM是最佳的基本培養(yǎng)基，效果明顯好于MS培養(yǎng)基；葉雯等[20]研究火焰南天竹(Nandinadomestica‘Firepower’)莖段組織培養(yǎng)優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)以WPM作為基本培養(yǎng)基進行誘導和增殖效果最佳，1/2WPM作為基本培養(yǎng)基進行生根誘導生根率達95%；倪鐘等[21]對北京地區(qū)優(yōu)良梅花(Armeniacamume)進行莖段啟動培養(yǎng)研究時也發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基。因此，為給植物生長提供適宜的營養(yǎng)供給，對培養(yǎng)基種類的篩選非常必要，篩選合適的培養(yǎng)基是植物組培快繁成功的第一步。本研究也發(fā)現(xiàn)NH4+和NO3-濃度較低的WPM培養(yǎng)基更適合巴西人參初代芽誘導和繼代增殖，更低的NH4+和NO3-濃度的1/2WPM培養(yǎng)基更有助于巴西人參根的誘導和生長。

基本培養(yǎng)基配合適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑，才能更好地誘導細胞分裂、芽和根的分化等。植物生長調(diào)節(jié)劑是影響細胞分裂和組織分化的重要因素，能夠在極低濃度下調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，植物種類不同，細胞分裂和組織分化所需的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度不同[22]。針對培養(yǎng)材料的種類、來源和生長期的不同，篩選植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，既是組培工作的重點也是難點，細胞分裂素和生長素是常用的植物生長調(diào)節(jié)劑[23]，二者之間的比例對器官再生途徑起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[24]。凌征柱等[14]研究巴西人參組培時繼代培養(yǎng)基選用MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L時40 d為一個增殖周期，增殖系數(shù)最高，為3.92，生根培養(yǎng)基選用1/2 MS + NAA 1.0 mg/L時15 d獲得生根植株；劉園[15]研究巴西人參組織培養(yǎng)技術(shù)時提出繼代培養(yǎng)基選用MS+6-BA 1.2～1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L時增殖系數(shù)最高，為3.22～3.92，生根培養(yǎng)基選用1/2MS+NAA 1.0 mg/L或1/2MS+PP333 0.2 mg/L時，生根率在90%以上；Flores等[25]研究BA和TDZ對巴西人參生長的影響時認為以莖節(jié)數(shù)量作為衡量指標不添加細胞分裂素的MS更適合巴西人參的生長；Nicoloso等[26]采用不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基，40 d可發(fā)育成完整植株，移栽成活率為95%。本研究通過正交試驗更加簡便高效地篩選了繼代培養(yǎng)基(WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)和生根培養(yǎng)基(1/2WPM+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+PP333 200 mg/L)，25 d作為繼代周期，增殖系數(shù)可達5.21以上，平均組培9.85 d即可生根，生根率高達98.85%，相對來說更加適合巴西人參組培快繁。

接種方式也是影響苗木再生的關(guān)鍵之一，付傳明等[27]研究發(fā)現(xiàn)采用水平接種的方式可誘導出更多的根系；劉海龍等[28]研究發(fā)現(xiàn)接種方式是影響澳洲茶樹(Melaleucaalternifolia)增殖系數(shù)的最主要因素，將1 cm以上單芽剪碎平鋪在培養(yǎng)基上增殖效果最佳。本研究采用平鋪方式接種，在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間內(nèi)，增殖系數(shù)顯著提高，這可能是因為水平的接種方式在一定程度上增加了材料與培養(yǎng)基的接觸面積，更有利于接種材料對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[16]。

移栽是植物組織培養(yǎng)的最后一個環(huán)節(jié)，盡管移栽過程和方法比較簡單，但移栽基質(zhì)的選擇至關(guān)重要，不經(jīng)篩選盲目地移栽會導致組培苗大量死亡，以致前功盡棄[29]。在適宜的環(huán)境條件下，移栽基質(zhì)的透氣性和含水量對誘發(fā)新根和移栽成活率影響較大[30]，在移栽時選擇不同配比的基質(zhì)，使得基質(zhì)更加透氣、保肥、保水，可以得到較高的移栽成活率[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，河沙作為移栽基質(zhì)相對通氣透水，但保肥力差，紅心土透氣性相對較差，兩者移栽成活率低；而采用通氣、透水性和保肥力好的移栽基質(zhì)(尤其椰糠︰谷殼=4︰1)，巴西人參的移栽成活率較高，可達98.67%。

綜上所述，巴西人參的最佳初代誘導培養(yǎng)基為：WPM+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.4 mg/L，誘導率達90.65%，平均萌芽數(shù)為2.90個，平均芽高2.70 cm；最佳的繼代增殖培養(yǎng)基為WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，采用平鋪的方式接種，培養(yǎng)25 d增殖系數(shù)可達5.21；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2WPM+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+PP333 200 mg/L，平均9.85 d即可生根，生根率高達98.85%，平均生根數(shù)為18.87條；移栽基質(zhì)選擇椰糠︰谷殼=4︰1(v/v)，移栽成活率最高，可達98.67%。建立的組培快繁技術(shù)體系可適用于巴西人參工廠化育苗生產(chǎn)，為巴西人參快速繁殖，緩解種苗短缺的市場需求提供了技術(shù)保障。