構(gòu)建MS2-RIP方法用于鑒定lncRNA DANCR 在腫瘤細(xì)胞中的相互作用分子

巫孟師，熊敏敏，彭 丹，韓 雪，鐘小敏

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究中心，廣東廣州 510080）

DANCR（differentiation antagonizing non-protein coding RNA）是一個(gè)最初在人表皮祖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)具有維持細(xì)胞未分化狀態(tài)功能的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）分子［1］。近年來的研究顯示，DANCR 在多種腫瘤中存在異常高表達(dá)的現(xiàn)象，提示其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用［2-7］。雖然DANCR 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要功能逐漸被揭示，但是對于DANCR 作為癌基因（oncogene）的作用機(jī)制尚未完全探討清楚。研究結(jié)果表明，lncRNA 發(fā)揮功能的主要方式之一是直接結(jié)合具有調(diào)控功能的蛋白質(zhì)或核酸分子［8-11］。為了闡明DANCR 在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)理，本研究致力于構(gòu)建一種基于MS2 RNA 結(jié)合蛋白的特性，用于鑒定與DANCR 相互作用的生物活性分子的新方法。MS2 RNA 結(jié)合蛋白實(shí)質(zhì)為RNA型噬菌體MS2 外表面的衣殼蛋白，通過特異性結(jié)合噬菌體復(fù)制酶編碼基因5’端由19 個(gè)核苷酸組成的RNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即MS2 結(jié)合位點(diǎn)（MS2 Bind?ing Site，MS2 BS），起著保護(hù)噬菌體核酸以及抑制翻譯的作用［12］。本研究計(jì)劃構(gòu)建表達(dá)Flag-MS2-EGFP 融合蛋白以及串聯(lián)表達(dá)DANCR-MS2 BS 的兩種載體，使用Flag 抗體對MS2 RNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫沉淀，同時(shí)對DANCR-MS2 BS 進(jìn)行富集，并進(jìn)一步使用已被證明為DANCR 相互作用分子的EZH2 蛋白作為陽性對照［11］，驗(yàn)證MS2-RIP 方法的效果。成功構(gòu)建MS2-RIP 方法，對于探討DANCR 的工作機(jī)理具有重要的推動(dòng)作用，也可以為鑒定其他lncRNA 的相互作用分子提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、菌株及質(zhì)粒

人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞（購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）及大腸桿菌菌株DH5α（購于天根生化科技有限公司）。pPyCAGIP（由Prof.Austin Smith from University of Cambridge 贈(zèng)予），pSL-MS2-12X 和pMS2-GFP質(zhì)粒（購于Addgene公司）。

1.2 試 劑

DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（購于天根生化科技有限公司）；限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、SacⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ（購于New England BioLabs 公司）；Infusion kit（購自Takara 公司）；Mil?lipore RIP 試劑盒（購自Millipore 公司）；RNA 提取試劑TRI-Reagent（購自MRC公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司）；TGXStain-Free丙烯酰胺免染制膠試劑盒（購自Bio-Rad 公司）；熒光定量PCR 試劑（購于Roche 公司）；EZH2 抗體試劑（購自Cell Signaling Technology 公司）；ViaFect轉(zhuǎn)染試劑（購于Promega 公司）；ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads 試劑盒（購自Sigma 公司）；RNA pulldown 試劑盒（購自ThermoFisher 公司）；IP Lysis buffer（購自ThermoFisher 公司）。本文所用引物及探針由生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1，探針序列見表2。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116 細(xì)胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國），添加100 mL/L胎牛血清（PAN，德國）及雙抗（100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素；Hyclone，美國），置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP質(zhì)粒構(gòu)建

以pMS2-GFP 質(zhì)粒為模板，用MS2-GFP-F 和MS2-GFP-R 引物擴(kuò)增MS2-GFP 開放閱讀框。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收電泳產(chǎn)物。然后用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和SacⅠ酶切載體Flag/pPyCAGIP，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收電泳產(chǎn)物。將回收的MS2-GFP 片段和線性載體用Infusion 酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，使用氨芐抗性的LB 平板篩選陽性克隆。挑取單克隆搖菌擴(kuò)增，提質(zhì)粒，送生工生物測序。測序正確的菌液轉(zhuǎn)移至30 mL含氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，取0.5 mL 菌液與0.5 mL 已滅菌的30%甘油混合保存于-80 ℃，剩余菌液使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.5 DANCR-MS2 BS(12X)/pPyCAGIP質(zhì)粒構(gòu)建

以pSL-MS2-12X質(zhì)粒為模板，用MS2（12X）-F和MS2（12X）-DANCR-R 引物擴(kuò)增MS2 BS（12X）片段。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收電泳產(chǎn)物。以HCT116 細(xì)胞提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用MS2（12X）-DANCR-F 和DANCR-R1 引物擴(kuò)增DANCR 片段，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收電泳產(chǎn)物。然后用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切載體pPyCAGIP，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收電泳產(chǎn)物。將回收的MS2 BS（12X）片段、DANCR 片段和線性載體用Infusion 酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，使用氨芐抗性的LB 平板篩選陽性克隆。挑取單克隆搖菌擴(kuò)增，提質(zhì)粒，送生工生物測序。測序正確的菌液轉(zhuǎn)移至30 mL 含氨芐抗性的液體LB 培養(yǎng)基中搖菌過夜，取0.5 mL 菌液與0.5 mL 已滅菌的30%甘油混合保存于-80 ℃，剩余菌液使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

表1 載體構(gòu)建引物Table 1 Primers for constructing vectors

表2 RNA pulldown的探針序列Table 2 Probe sequences for RNA pulldown

1.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀

接種50%密度的HCT116 細(xì)胞于100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑（μL）與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（μg）的比例是3∶1，用1 mL Opti-MEM稀釋質(zhì)粒。質(zhì)粒用量和組合分別為12 μg Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和8 μg DANCR-MS2 BS（12×）/pPyCAGIP、12 μg Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和8 μg DANCR/pPyC?AGIP、12 μg pPyCAGIP 和8 μg DANCR-MS2 BS（12×）/pPyCAGIP。室溫放置5 min，分別加入60 μL ViaFect 轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻室溫放置15 min。將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基換成無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，然后將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中。24 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后用2.5 g/L胰酶消化后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀確定細(xì)胞數(shù)量。取1×107個(gè)細(xì)胞至1.5 mL干凈EP管中，用預(yù)冷的PBS洗兩遍后加入50 μL lysis buffer裂解細(xì)胞，放置于-80 ℃過夜。將細(xì)胞裂解液從-80 ℃取出于冰上解凍，每個(gè)樣品各取出5 μL input（RNA）和5 μL input（蛋白），然后分別加入430 μL wash buffer，17.5 μL 0.5 mol/L EDTA，2.5 μL RNase Inhibitor，吹打混勻，于4 ℃10 000 ×g離心10 min。取30 μL ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads 懸液，用RIP kit 里的wash buffer洗兩遍。取離心后的上清于準(zhǔn)備好的磁珠中，4 ℃孵育過夜。用wash buffer 洗磁珠5 次，然后將磁珠分成兩份，分別用于RNA和蛋白質(zhì)提取。

1.7 RNA pulldown

使用Primer3 網(wǎng)站設(shè)計(jì)探針序列，并由生工生物合成5’端帶生物素標(biāo)記的探針。取1 pmol 探針和50 μL Pierce Nucleic-Acid Compatible Streptavi?din Magnetic Beads 常 溫結(jié)合30 min。取1×107個(gè)HCT116 細(xì)胞至1.5 mL 干凈EP 管中，加入120 μL IP Lysis Buffer 裂解細(xì)胞，冰上放置5 min 后，加入20 μL Protein-RNA Binding Buffer（10×）、60 μL 50%甘油，吹打混勻，于4 ℃10 000×g離心10 min。分別取20μL 上清作為RNA input 和總蛋白input，將剩下的上清加入結(jié)合探針的磁珠中，4 ℃孵育過夜。用1×wash buffer 洗磁珠2次，然后將磁珠分成兩份，分別用于RNA和蛋白質(zhì)提取。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

加入500 μL Trizol 到用于RNA 提取的磁珠中，顛倒混勻，室溫放置15 min，加入200 μL DEPC水，顛倒混勻后室溫放置15 min，4 ℃，12 000×g離心15 min，取600 μL 上清至新的1.5 mL 離心管中，加入等體積的異丙醇和5 μg 糖原后充分混勻，室溫放置10 min，4 ℃，10 000×g離心15 min，管底可見白色沉淀。棄上清，每管加入400 μL 750 mL/L乙醇漂洗，4 min，5 000 ×g，棄上清后，重復(fù)一遍漂洗過程，晾干RNA 沉淀至邊緣透明時(shí)加入適量DEPC 水溶解，提取的RNA 全部按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，q-DANCR-F：GCCACTATGTAGCGGGTTTC；

q-DANCR-R：GCCTGTAGTTGTCAACCTGC；q-U1-F：TTTCCCAGGGCGAGGCTTAT；q-U1-R：TGCAG?TCGAGTTTCCCACATT，熒光定量PCR 每孔體系為：cDNA 1 μL、SYBR 5 μL、引物2 μL、水2 μL，總體系10 μL，熒光定量PCR儀檢測，數(shù)據(jù)分析。

1.9 蛋白免疫印跡

加入適量的1× loading buffer 到用于蛋白提取的磁珠中，95 ℃處理10 min，于磁力架上取含蛋白的上清至新的EP 管中備用。Western blot 10%預(yù)混膠配制，①分離膠：3 mL Resolver A，3 mL Re?solver B，30 μL 10% APS（Ammonium persulfate，過硫酸銨），3 μL TEMED。②濃縮膠：1 mL Stacker A，1 mL Stacker B，10 μL 10% APS（Ammonium persulfate，過硫酸銨），2 μL TEMED。取準(zhǔn)備好的樣品進(jìn)行垂直電泳，200 V，30 min。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜到0.45 μm 聚偏二氟乙烯（PVDF）上，200 mA 60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。用5% BSA 配制EZH2 一抗，4 ℃孵育過夜。取出室溫?fù)u床上再繼續(xù)孵育30 min后，用TBS/T洗3次，5 min/次；加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。用TBS/T 洗3次，5 min/次，加入化學(xué)發(fā)光底物ECL，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測條帶。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 26.0 完成。兩組計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料的比較進(jìn)行單因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)多重比較采用LSD、Dunnett'st檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建重組載體Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和DANCR-MS2 BS(12×)/pPyCAGIP

本研究構(gòu)建了兩個(gè)重組載體Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和DANCR-MS2 BS（12×）/pPyCAGIP，用于下游MS2-RIP 實(shí)驗(yàn)。Flag-MS2-EGFP/pPyCA?GIP 載體用于外源過量表達(dá)帶有Flag 標(biāo)簽和GFP熒光蛋白的MS2 RNA 結(jié)合蛋白。Flag 標(biāo)簽由于其氨基酸序列較短，一般不會(huì)干擾融合蛋白（本研究中為MS2 蛋白）的天然構(gòu)象。另外，耦聯(lián)高特異性Flag 抗體的磁珠，較容易從商品化渠道購買獲得，可保證不同批次的RIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。因此，我們在構(gòu)建重組載體時(shí)，引入Flag標(biāo)簽至MS2蛋白的N 端，用于高效捕獲MS2 蛋白。另外，MS2 蛋白的C端還帶有融合表達(dá)的EGFP蛋白，便于直接觀察融合蛋白Flag-MS2-EGFP 的表達(dá)效率。DANCRMS2 BS（12×）/pPyCAGIP 載體用于過量表達(dá)5’端帶有MS2 BS（12個(gè)拷貝）的重組型DANCR 轉(zhuǎn)錄本。帶有MS2 BS 的DANCR，可有效地被MS2 蛋白識別及捕獲，并且不受DANCR 本身序列性質(zhì)的影響。該策略的另一個(gè)優(yōu)勢是，MS2蛋白的作用位點(diǎn)獨(dú)立于DANCR轉(zhuǎn)錄本，因此不會(huì)干擾其他與DANCR相互作用的分子的結(jié)合。另外，我們還構(gòu)建了不帶有MS2 BS 的DANCR 重組載體DANCR/pPyCAGIP 作為對照，用于評估系統(tǒng)性的非特異結(jié)合背景。以上質(zhì)粒的構(gòu)造見示意圖1。

2.2 檢測重組載體的表達(dá)效率

將下列三組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞：（Test group）Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP 和DANCR-MS2 BS（12×）/pPyCAGIP；（Control group 1）Flag-MS2-EGFP/pPyCAGIP和DANCR/pPyCAGIP；（Controlgroup 2）pPyCAGIP 和DANCR-MS2 BS（12×）/pPyCAGIP。轉(zhuǎn)染后48h，檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度和DANCR 的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后的HCT116 細(xì)胞熒光和明場合成圖如圖所示（圖2A），Test group 和Control group 1 的熒光強(qiáng)度相近，綠色熒光蛋白成功表達(dá)。隨后，提取HCT116 細(xì)胞的總RNA 檢測DANCR 的過表達(dá)水平。結(jié)果如圖2B 所示，Test group，Control group 1和Control group 2 中，DANCR 的表達(dá)水平分別為WT HCT116 細(xì)胞的（427.35±10.13）倍，（348.60±6.14）倍，以及（523.37±3.76）倍。（4組樣本量分別為3，做單因素方差分析F=4019.50，P<0.001；Dun?nett'st檢驗(yàn)中，Test group 與WT 相比較，P<0.001；Control group 1 與WT 相 比 較，P<0.001；Control group 2與WT相比較，P<0.001）

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組示意圖Fig.1 Diagram of plasmid construction and plasmid combinations of groups

2.3 MS2-RIP方法的富集效果

如上所述，將Test group，Control group 1和Con?trol group 2 三組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞。48 h后收集1×107細(xì)胞進(jìn)行MS2-RIP 實(shí)驗(yàn)（圖3）。從MS2-RIP 獲得的免疫沉淀復(fù)合物提取RNA，用于檢測DANCR的富集效果，并以U1作為參照。熒光定量PCR 結(jié)果如圖4A 所示，與Control group 1、2比較，Test group 中DANCR 有明顯的富集效果。Test group 富集的DANCR 占相應(yīng)input 的比例為（0.083 5±0.004 8）%，而兩個(gè)Control group 分別為（0.007 7±0.007 2）%及（0.004 3±0.003 4）%，Test group 與兩組Control group 的差異都具有統(tǒng)計(jì)意義（3 組樣本量分別為3，單因素方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=203.665，3 組DANCR 的富集水平有差異；LSD 檢 驗(yàn) 結(jié)果 表 明，Test group 與Control group 1相 比 較，P<0.001；Test group 與Control group 2 相比較，P<0.001；Control group 1 與Control group 2 相比較，P=0.475；圖4A，左）。然而，Test group 對非編碼RNA U1 的富集量為（0.081 9±0.021 8）%，與兩個(gè)Control group 的富集量（0.087 5±0.010 6）%和（0.060 0±0.002 9）%相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)意義（3 組樣本量分別為3，單因素方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=3.17，P=0.115；圖4A，中）。同時(shí)，我們用Western blot 方法檢測了免疫沉淀復(fù)合物中與DANCR 相結(jié)合的蛋白質(zhì)，即陽性對照EZH2蛋白。如圖4A結(jié)果顯示，Test group 的免疫沉淀樣品可顯著檢測到EZH2 蛋白，而Control group 1 和Control group 2 中EZH2信號均為陰性（圖4A，右）。

圖2 重組質(zhì)粒表達(dá)效率檢測Fig.2 Expression efficiency of recombinant vectors

圖3 MS2-RIP流程示意圖Fig.3 A schematic diagram of the MS2-RIP strategy

為了更好地驗(yàn)證MS2-RIP 方法的有效性，我們還與廣泛使用的RNA pulldown 方法進(jìn)行了比較。RNA pulldown 方法，通過設(shè)計(jì)兩種不同的可與DANCR 的序列進(jìn)行堿基反向互補(bǔ)的DNA 探針（DANCR1 和DANCR2），達(dá)到對DANCR 及其相互作用分子的捕獲。如圖4B 所示，兩種探針均對DANCR 有一定的富集效果，DANCR1 為（0.040 6 ±0.009 6）%，DANCR2 為（0.050 1 ± 0.017 8）%，相應(yīng)的對照ctrl1 和ctrl2 分別為（0.007 0±0.003 4）%及（0.007 6±0.003 8）%。DANCR1 與ctrl1、DANCR 與ctrl2的差異都具有統(tǒng)計(jì)意義（ctrl1和DANCR1的樣本量均為6，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=8.033，P＜0.05，顯示兩組DANCR 的富集水平有差異；ctrl2和DANCR2 的樣本量均為3，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=-4.022，P＜0.05，顯示兩組DANCR 的富集水平有差異；圖4B，左）。DANCR1、DANCR2對非編碼RNA U1 的富集量為分別為（0.041 3±0.014 6）%和（0.186±0.0671）%，與ctrl1、ctrl2的富集量（0.062 8±0.018 6）%和（0.305±0.094）%分別相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)意義（ctrl1 和DANCR1 的樣本量均為6，ctrl1和DANCR1 的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=-2.22，P=0.51；ctrl2 和DANCR2 的 樣本 量 均 為3，ctrl2和DANCR2 的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=1.78，P=0.15）（圖4B，中）。同時(shí)，Western blot 結(jié)果顯示，DANCR1 和DANCR2 的免疫沉淀樣品均能檢測到EZH2 蛋白，而ctrl1 及ctrl2 中EZH2 信號均為陰性（圖4B，右）。

對MS2-RIP和RNA pulldown方法的結(jié)果進(jìn)行比較，如圖4C 所示，RNA pulldown 方法的陽性探針組（DANCR1和DANCR2）對DANCR的富集效率（分別為（0.040 6±0.009 6）%和（0.050 1±0.017 8）%），低于MS2-RIP 方法的Test group（0.083 5±0.004 8）%（DANCR1 組樣本量為6，DANCR2 和Test group 組樣本量分別為3，單因素方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=14.492，P<0.05，3 組DANCR 的富集水平有差異；Dunnett'st檢驗(yàn)結(jié)果表明，Test group 與DANCR1相比較，P<0.05；Test group 與DANCR2 相比較，P<0.05）。另外，對上述兩種方法捕獲的EZH2蛋白的Western Blot條帶進(jìn)行光密度定量分析（圖4C，右），結(jié)果顯示MS2-RIP 方法對EZH2 蛋白的富集效果優(yōu)于RNA pulldown 方法。MS2-RIP 的Test group 富集的EZH2 蛋白占其input 的比例為（8.09±3.29）%，而DANCR1 和DANCR2 富集的EZH2 蛋白占相應(yīng)input 的比例分別為（1.5±1.1）%及（2.28±0.99）%。Test group 與DANCR1、Test group 與DANCR2 的 差異都具有統(tǒng)計(jì)意義（3 組樣本量分別為3，單因素方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=10.204，P<0.05，3 組EZH2的富集水平有差異；Dunnett'st檢驗(yàn)結(jié)果表明，Test group 與DANCR1 相比較，P<0.05；Test group 與DANCR2相比較，P<0.05）。

以上結(jié)果說明，MS2-RIP方法可以高度特異性地富集目標(biāo)RNA DANCR，而對非特異性RNA U1分子沒有顯著的富集作用，因此可用于下游進(jìn)一步檢測共同被捕獲的DANCR 相互作用分子。同時(shí)，對比廣泛使用的RNA pulldown 方法，MS2-RIP 方法富集DANCR 和捕獲EZH2 蛋白的效率明顯更高，說明MS2-RIP 方法將來可用于有效鑒定更多未知的DANCR相互作用分子。

圖4 MS2-RIP 方法的富集效率Fig.4 The enrichment efficiency of MS2-RIP strategy

3 討論

長鏈非編碼RNA 作為一類長度大于200 個(gè)核苷酸、通常不具有蛋白質(zhì)編碼能力的內(nèi)源性RNA，能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而廣泛地參與包括細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育在內(nèi)的重要生命過程，其異常表達(dá)還與多種人類重大疾?。ㄈ缒[瘤）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來關(guān)于lncRNA 的研究進(jìn)展迅猛，但是絕大部分lncRNA 的作用機(jī)制仍不清楚。LncRNA DANCR基因是一個(gè)位于人類染色體4 號，長度為915 bp 的長鏈非編碼RNA，最初在人表皮祖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)具有維持細(xì)胞未分化狀態(tài)的功能［1］。廣泛的研究數(shù)據(jù)表明，DANCR 可以作為腫瘤的標(biāo)志物，其在多種腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤以及腫瘤血管新生等有密切關(guān)聯(lián)［13-16］，可作為靶向性治療腫瘤的新靶標(biāo)。然而，目前對于lncRNA DANCR 功能和機(jī)制的研究尚未完善。

以往的研究報(bào)道，lncRNA 行使功能的機(jī)制大部分體現(xiàn)在從不同的水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，包括染色質(zhì)的表觀遺傳修飾水平，轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平，mRNA 穩(wěn)定性水平，以及翻譯調(diào)控水平。而且，lncRNA常以與蛋白質(zhì)、RNA或DNA相結(jié)合的方式，參與調(diào)控基因表達(dá)。例如，在間充質(zhì)干細(xì)胞中，DANCR可與表觀遺傳修飾因子EZH2蛋白結(jié)合，影響RUNX2 基因表達(dá)，抑制成骨分化［11］。lncRNA HOTAIR 既可結(jié)合蛋白質(zhì)又可結(jié)合DNA，通過招募沉默復(fù)合物PRC2 和LSD1/CoREST/REST 復(fù)合物至特定DNA 區(qū)域，使組蛋白H3K27 和H3K4 分別進(jìn)行甲基化和去甲基化修飾，從而使其調(diào)控的一系列基因表達(dá)下調(diào)［10］。另外，一些lncRNA 的序列中含有microRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，可以行使海綿（sponge）作用對調(diào)節(jié)性microRNA 進(jìn)行吸附，從而使被microRNA 調(diào)控的mRNA 分子得到釋放，表達(dá)增加［8-9］。因此，鑒定與lncRNA 相互作用的生物活性分子，有助于準(zhǔn)確闡明lncRNA 的作用機(jī)制。

為了探討DANCR 在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)理，本研究致力于構(gòu)建一種用于鑒定與DANCR相互作用的生物活性分子的新方法。常見的鑒定lncRNA相互作用分子的方法包括RNA pulldown 和RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunopre?cipitation，RIP）。RNA pulldown 方法通過使用人工合成的序列互補(bǔ)性探針富集lncRNA，間接捕獲結(jié)合lncRNA 的生物活性分子。該方法受限于探針與靶標(biāo)的親和力，探針序列的特異性，以及探針與靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)可能覆蓋相互作用分子的結(jié)合序列等因素，因此其捕獲效率因不同lncRNA 分子而異。RIP 方法則使用lncRNA 的候選結(jié)合蛋白的特異性抗體，通過免疫共沉淀富集lncRNA-蛋白復(fù)合物，進(jìn)一步檢測lncRNA 在免疫沉淀復(fù)合物中的含量判斷二者結(jié)合的可能性或效率。然而，該方法要求lncRNA 結(jié)合蛋白已知，并且可獲得高特異性的抗體。因此，一般的RIP方法不適用于探討未知的lncRNA 結(jié)合蛋白，以及與lncRNA 結(jié)合的RNA/DNA 分子。為了解決上述問題，本研究構(gòu)建了一種基于MS2 RNA 結(jié)合蛋白特性，以DANCR 為誘餌捕獲相互作用分子的新方法。我們設(shè)計(jì)使DANCR 與多個(gè)拷貝的MS2 BS 形成串聯(lián)轉(zhuǎn)錄本，通過將帶有Flag 標(biāo)簽的MS2 RNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫沉淀，即可高效捕獲DANCR 及其相互作用分子。該方法的優(yōu)勢在于以下幾方面：①M(fèi)S2 RNA 結(jié)合蛋白與MS2 BS 的結(jié)合力強(qiáng)，通過人為增加MS2 BS 拷貝數(shù)，可使DANCR 的富集效率達(dá)到最優(yōu)化；②富集DANCR的關(guān)鍵作用位點(diǎn)為MS2 BS，該位點(diǎn)不屬于DAN?CR 轉(zhuǎn)錄本中的天然序列，可避免干擾DANCR 與其相互作用分子的結(jié)合；③商品化的Flag 抗體具有高度親和性和特異性，可使MS2 RNA 結(jié)合蛋白的免疫沉淀效率得到保證；④單獨(dú)使用MS2-RIP方法，即可同時(shí)檢測與DANCR 相互作用的蛋白質(zhì)或RNA 分子，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。

本文的研究結(jié)果初步表明，與RNA pulldown方法相比較，MS2-RIP方法由于利用了MS2蛋白與其特異性結(jié)合位點(diǎn)的親和力作為基礎(chǔ)，得以高效地富集DANCR；同時(shí)，MS2-RIP 實(shí)驗(yàn)要求外源性過量表達(dá)DANCR（形成DANCR-MS2 BS（12X）重組轉(zhuǎn)錄本），因此可增加被富集的DANCR 轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)，從而提高捕獲DANCR 結(jié)合蛋白EZH2的效果（圖4）。而且，與RNA pulldown 方法中探針結(jié)合序列可能覆蓋未知相互作用分子的結(jié)合位點(diǎn)的情況不同，MS2-RIP 方法對DANCR 的富集不依賴于DANCR 本身序列，可避免與潛在的相互作用分子發(fā)生競爭性結(jié)合，因此可提高捕獲DANCR 相互作用分子的效率。所以從理論上來說，MS2-RIP 方法可針對任意一種lncRNA 展開相互作用分子的鑒定及其作用機(jī)制探討，具有廣泛的適用性。

綜上所述，MS2-RIP方法可以達(dá)到特異性高效富集目的lncRNA DANCR 及其相互作用分子的目的。該方法為探討lncRNA DANCR 的作用機(jī)制，以及鑒定其他lncRNA 的相互作用分子提供了一種新的策略。