胡蘿卜種質(zhì)資源多樣性及聚類分析

常雙鋒，劉真真，趙宇璇，王鑫煜，武 喆

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801）

胡蘿卜（Daucus carota L.var.sativa DC.）是傘形花科胡蘿卜屬2 年生草本植物，其肉質(zhì)根中含有豐富的類胡蘿卜素，是提供人體所需類胡蘿卜素的主要蔬菜之一[1-2]。我國是世界上胡蘿卜種植面積最大的國家之一，到2012 年我國胡蘿卜種植面積達到47.2 萬hm2，占世界胡蘿卜種植面積的39.4%。胡蘿卜種質(zhì)資源豐富，全世界共有5 600 份，我國僅搜集保存了389 份[3]。為豐富我國胡蘿卜種質(zhì)資源，對其遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定是新品種選育的關(guān)鍵，同時也為挖掘優(yōu)良基因奠定了基礎(chǔ)。近年來，對胡蘿卜種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究已有相關(guān)報道。趙彥等[4]采用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)，將34 份胡蘿卜種質(zhì)資源材料聚為5 類，8 個亞類。馬振國等[5]結(jié)合表型性狀和SSR 標(biāo)記對70 份國內(nèi)外胡蘿卜種質(zhì)材料進行分析，結(jié)果表明，橘紅色栽培品種的多樣性指數(shù)低于地方資源，地方資源的平均多態(tài)性位點高于橘色栽培種，聚類分析將這些資源分為2 組。但已有研究所關(guān)注的表型性狀較為有限，不利于對種質(zhì)資源綜合性狀的利用。而表觀形態(tài)學(xué)鑒定及聚類分析是當(dāng)前園藝植物中進行種質(zhì)資源調(diào)查的2 種常用方法，目前已被應(yīng)用在多種作物上，如大麥[6]、大豆[7]、甜瓜[8]、柑橘[9]等，但在胡蘿卜作物上還未被應(yīng)用。

本研究從山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院胡蘿卡課題組收集的種質(zhì)材料中篩選了37 份具有代表性的地方資源和栽培品種，對田間27 個主要的表型性狀進行調(diào)查研究，采用43 對多態(tài)性SSR 引物分析不同種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系，旨在為胡蘿卜種質(zhì)資源的進一步利用、創(chuàng)新和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

表1 供試胡蘿卜種質(zhì)資源

試驗所用材料37 份，包括橙色材料28 份、黃色材料4 份、紫色材料4 份、白色材料1 份，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院收集。胡蘿卜種質(zhì)資源材料信息如表1 所示。

1.2 試驗方法

試驗材料于2017 年春季在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院試驗站種植。采用露地半高壟方式栽培，行距15 cm，株距10 cm，每份材料種植10 株，調(diào)查3～5 株，常規(guī)管理。

1.2.1 胡蘿卜田間表型性狀的調(diào)查及分析 田間表型性狀主要分為2 類，一類為地上部，包括葉基盤寬度、葉基盤位置、葉型、葉數(shù)、葉裂深淺、葉色、葉長、葉寬、葉面絨毛、葉柄色、葉柄基部花青素；另一類為地下部，包括根長、根粗、根形、根肩部大小、根肩型、根肩綠色程度、根肩綠肉程度、根尖形狀、根表皮狀況、根眼大小、根表皮顏色、肉質(zhì)根肉色、根形成層顏色、根心柱色、根心柱大小、單根質(zhì)量。具體鑒定標(biāo)準(zhǔn)及方法依據(jù)胡蘿卜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進行[10]。

將27 個性狀的測量值分別用Excel 計算出最大值、最小值、平均值（X）、標(biāo)準(zhǔn)差（σ），然后進行10 級分類[11]，其中，10 級≥X+2σ，1 級＜X-2σ，中間每級別相差0.5σ；由標(biāo)準(zhǔn)差和平均數(shù)計算變異系數(shù)（CV）；根據(jù)每個性狀占總分?jǐn)?shù)的百分比計算其多樣性指數(shù)（H′）。

使用SAS 9.2 軟件對27 個田間表型性狀進行主成分分析和聚類分析。

式中，Pi 為某性狀第i 級材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比。

1.2.2 SSR 標(biāo)記分析 采用CTAB 法提取胡蘿卜基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000C 核酸儀檢測定其純度和濃度。

從CAVAGNARO 等[12]研究得出的304 對SSR引物中選擇均勻分布于9 條染色體上的72 對進行多態(tài)引物的篩選，篩選出的43 對引物如表2 所示。其中，PCR 反應(yīng)體系的dNTP、Taq 酶購于南京擎科生物有限公司。

PCR 反應(yīng)體系及擴增條件為：PCR 反應(yīng)體系10 μL，包括ddH2O 1 μL、Mix Buffer 5 μL、正向引物（50 ng/μL）1 μL、反向引物（50 ng/μL）1 μL、模板DNA 2 μL；PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

銀染體系為：7.2%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，180 V恒壓，電泳1.5 h 左右，銀染顯色，在熒光燈屏上觀察并拍照。在相同位置出現(xiàn)條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。統(tǒng)計好后，將數(shù)據(jù)以Microsoft Excel 5.0/95 工作薄的格式存盤，利用NTedit 導(dǎo)入文件，存為NTS 格式；利用NTSYS pc 2.0 軟件處理，進行聚類分析[13]。

表2 43 對多態(tài)性豐富的SSR 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀分析

由表3 可知，37 份胡蘿卜種質(zhì)資源平均葉基盤寬度為22.8 mm，極差為95.6 mm；平均葉片數(shù)為11 片，極差為12 片；平均葉長為39.9 cm，極差為42.0 cm；平均葉寬為19.9 cm，極差為25.0 cm；平均單根質(zhì)量為125.9 g，極差為267.5 g；平均根心柱大小為16.0mm，極差為16.6mm；平均根長為156.6 mm，極差為99.1 mm；平均根尾粗度為38.3 mm，極差為36.6 mm；平均根頭粗度為10.2 mm，極差為20.9 mm。9 個數(shù)量性狀的變異系數(shù)平均值為33.3%，其中，葉基盤寬度、肉質(zhì)根單根質(zhì)量和根頭粗度的變異系數(shù)分別為64.6%、50.6%和36.2%，均超過平均值，說明這3 個性狀變異豐富；其余6 個數(shù)量性狀均小于平均值，表明其遺傳特性相對穩(wěn)定。9 個數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)平均值為1.60，葉寬最大，為1.97，葉基盤寬度最小，為1.09，說明這9 個性狀在每組內(nèi)分布情況相似。

表3 供試胡蘿卜種質(zhì)資源的數(shù)量性狀分析

從表4 可以看出，37 份胡蘿卜種質(zhì)資源材料分布較為廣泛，如葉色中綠色、灰綠色和紫綠色的分布頻率分別是78.4%、2.7%、13.5%，其中，未發(fā)現(xiàn)黃綠色或深綠色（分布頻率為0）葉片；葉柄基部花青素由輕到重的分布頻率依次為無（51.2%）、輕（32.4%）、中（5.4%）以及重（10.8%）；根肩綠色程度根據(jù)無或很少、少、中等、多、非常多的比例分別為13.5%、18.9%、10.8%、18.9%、37.8%；另外，在根表皮顏色中，白色占2.7%，黃色占10.8%、橘黃色占75.7%、紫紅色占8.1%、紫色占2.7%，沒有發(fā)現(xiàn)橘紅色和紅色根表皮材料。18 個性狀的平均多樣性指數(shù)為0.72，根肩綠色程度的多樣性指數(shù)最大，為1.51；11 個性狀多樣性指數(shù)介于0 和1 之間，分別為葉柄色（0）、葉基盤位置（0.25）、葉型（0.13）、葉裂深 淺（0.76）、葉 色（0.56）、根 肉 色（0.82）、根 型（0.25）、根肩型（0.25）、根尖形狀（0.54）、根表皮狀況（0.4）和根表皮顏色（0.85），說明供試胡蘿卜種質(zhì)材料在這11 個性狀上表現(xiàn)型類型較少或類型分布不均勻。

表4 胡蘿卜種質(zhì)資源質(zhì)量性狀分布頻率和多樣性指數(shù)分析

2.2 主成分和聚類分析

基于表型性狀的主成分分析，得出遺傳相關(guān)矩陣的特征值，選取前2 個較大的特征值，能夠代表27 個田間性狀90.91%的變異。由表5 可知，第1 主成分特征值為2 904.435，貢獻率達77.310%，主要由單根質(zhì)量（0.973）決定；第2 主成分特征值為510.864，貢獻率達13.600%，主要由根長（0.988）決定。

表5 27 個田間性狀的主成分分析

對37 份胡蘿卜種質(zhì)進行聚類分析，在距離系數(shù)約為1.07 的位置，將其分為六大類群（圖1），其中，第1 類包括A10，為常規(guī)品種，橙色；第2 類包括A35，為1 代雜種，橙色；第3 類包括A8，為常規(guī)品種，橙色；第4 類包括A13，也是常規(guī)品種，橙色；第5 類包括A16、A24、A37、A9 和A2，除A37 為橙色外其他都是紫色；第6 類包括白色A15，淺黃色A23，黃色A14、A18、A21、A25 以及其他橙色資源。

2.3 SSR 標(biāo)記的聚類分析

通過對72 對引物的篩選，共篩選出43 對多態(tài)性豐富、條帶清晰的SSR 引物（以引物GSSR-6 為例，圖2），43 對SSR 引物共擴增出171 條帶，其中，多態(tài)位點153 個，多態(tài)率為89.5%，每對引物擴增出的條帶數(shù)為1～8 條，平均每對引物擴增出3.8 條。

聚類分析結(jié)果表明（圖3），37 份胡蘿卜材料可分為3 類，其中，第1 類包括A23，為地方品種，淡黃色；第2 類包括A15 和A17 共2 種，顏色分別為白色和橙色；第3 類由絕大多數(shù)橙色材料和其他資源組成，可分為2 個亞類，其中，第1 亞類包括A1、A2、A3、A4、A7、A11、A8、A10、A34、A5、A6、A12、A37、A35 和A36，除A2 為紫色外其他都為橙色，第2 亞類包括其他橙色資源，紫色A9、A16 和A24，黃色A14、A18、A25。

3 結(jié)論與討論

在選育胡蘿卜優(yōu)良品種時，需要綜合考慮地上部和地下部多個農(nóng)藝性狀指標(biāo)[14-16]。本試驗通過對37 份胡蘿卜種質(zhì)資源27 個性狀的變異和多樣性研究發(fā)現(xiàn)，9 個數(shù)量性狀中葉基盤寬度和肉質(zhì)根單根質(zhì)量變異系數(shù)較大，因此，可將胡蘿卜葉基盤寬度和肉質(zhì)根單根質(zhì)量作為初選指標(biāo)，而其他18 個質(zhì)量性狀中11 個性狀的多樣性指數(shù)均小于1，根肩綠色程度最大；進一步進行主成分分析，結(jié)果表明，單根質(zhì)量和根長是影響胡蘿卜遺傳多樣性的主要因子，研究結(jié)果與鄭思宇等[17]對于青蘿卜種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果相似，說明在以肉質(zhì)根為食用器官的根菜類中，地上部糖類等營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)與地下部儲藏器官的膨大密切相關(guān)。

37 份種質(zhì)材料的基因型鑒定結(jié)果將供試胡蘿卜種質(zhì)資源分為3 類，其中，第1 類為淡黃色地方品種；第2 類包括白色和橙色品種，說明白色和淡黃色胡蘿卜的親緣關(guān)系較遠，由于白色和淺黃色是早期野生胡蘿卜的2 種類型[18]；第3 類由絕大多數(shù)橙色材料、紫色和黃色資源組成，說明橙色、紫色和黃色材料之間親緣關(guān)系較近，這與BANGA 等[19]和IORIZZO 等[20]提出的橙色胡蘿卜可能由黃色栽培品種馴化而來的觀點相符；同時紫色胡蘿卜與橙色胡蘿卜也聚在了一起，這與RONG 等[21]的研究結(jié)果一致。

從本研究結(jié)果可以看出，表觀型遺傳距離的聚類結(jié)果與SSR 標(biāo)記遺傳距離的聚類結(jié)果存在不一致性，這在其他植物上也有報道[22-24]。原因可能是由于一方面受生長環(huán)境影響，另一方面形態(tài)學(xué)觀察需要一定的經(jīng)驗，且在統(tǒng)計過程中存在系統(tǒng)誤差，使表型聚類結(jié)果和基因型鑒定結(jié)果存在差異。

種質(zhì)資源的開發(fā)和利用需要掌握其遺傳多樣性和親緣關(guān)系。本研究通過對37 份胡蘿卜種質(zhì)的27 個農(nóng)藝性狀進行田間調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單根質(zhì)量和根長是影響其遺傳多樣性的主要因子；同時篩選得到43 個SSR，對其親緣關(guān)系的聚類分析結(jié)果表明，淡黃色地方品種齊頭黃為一支，白色常規(guī)品種白玉蘿卜和橙色常規(guī)品種拇指蘿卜為一支，其余品種分為2 個亞群聚為一支。通過主成分和聚類分析綜合評價胡蘿卜種質(zhì)材料，將有助于指導(dǎo)親本選配，可為促進胡蘿卜研究和育種改良提供重要的種質(zhì)資源和理論基礎(chǔ)。