基于ITS2和psbA-trnH序列的藥用甘草分子鑒定

崔秀婷，劉 俊，耿雅萍，田欣涓，劉亞令

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 211198）

甘草屬（Glycyrrhiza Linn.），屬于豆科蝶形花亞科，為多年生草本或半灌木，世界范圍內(nèi)約有20 種，大部分分布在歐亞大陸，且集中分布在亞洲中部。其中，我國有8 種，主要分布于黃河流域以北的省區(qū)，在云南西北部發(fā)現(xiàn)了個(gè)別種[1]。藥材甘草為豆科植物烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）或脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Batalin）的甘草根及根莖[2]。藥用甘草中含有多種活性成分，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力、抗?jié)?、解毒、抗肝纖維化等藥理作用，可與多種中藥配伍，藥效平緩，多起調(diào)和藥性的作用。目前，已從中分離出300 余種黃酮類成分，20 余種三萜皂苷類成分及多糖成分[3]，楊瑞等[4]對(duì)市售藥用甘草成分的含量測(cè)定表明，不同基原甘草的藥效有明顯不同，在臨床應(yīng)用中應(yīng)區(qū)別對(duì)待。但在實(shí)際市場上，由于中藥材甘草根部形態(tài)十分相似，采用傳統(tǒng)方法對(duì)中藥形狀、顏色、氣味等進(jìn)行鑒定，存在著較大的主觀性和經(jīng)驗(yàn)性[5]，不能達(dá)到較好的鑒定效果。要準(zhǔn)確鑒別藥用甘草品種，需要從多個(gè)方面進(jìn)行，比較繁瑣復(fù)雜[6]。因此，探尋一種準(zhǔn)確、有效、快速的鑒定方法十分必要。

DNA 條形碼（DNA barcoding）由加拿大分類學(xué)家HEBERT 等提出[7]，是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)短序列來進(jìn)行物種鑒定，具有準(zhǔn)確快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，是近年來基于分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展起來的一種物種鑒定新技術(shù)。DNA 條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定方法相比，是基于物種基因型的差異鑒定，且僅需少量組織材料即可實(shí)現(xiàn)物種鑒定，是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充[5]。眾多研究者對(duì)適合作為植物的DNA barcoding 進(jìn)行了積極的探索，對(duì)ITS2、matK、psbKpsbI、rbcL、rpoB、rpoC1、psbA-trnH、rps4、trnL-trnF 和atpF-atpH 等條形碼進(jìn)行了研究[8]。其中，rbcL＋matK在生命條形碼國際聯(lián)盟植物工作組的建議下被作為核心條形碼，隨后生命條形碼聯(lián)盟植物工作組在第三屆國際DNA 條形碼會(huì)議上建議將葉綠體psbA-trnH 片段和核基因片段ITS 作為補(bǔ)充條形碼[9]。

隨著DNA 分子條形碼的發(fā)展，ITS、ITS2、psbAtrnH、matK 與rbcL 等相繼對(duì)甘草屬植物嘗試鑒別，得出利用ITS2 序列和psbA-trnH 序列2 種DNA條形碼鑒定甘草屬植物效果最好[10-11]。陳士林等[12]建議選用ITS2 和psbA-trnH 序列為植物類藥材的核心條形碼，同時(shí)建立了中藥材DNA 條形碼鑒定體系，其良好的鑒定能力也已得到眾多研究者的認(rèn)可[13-16]。由于目前對(duì)甘草屬雜交區(qū)親本和雜交類群形態(tài)分化沒有明確的分類依據(jù)和認(rèn)識(shí)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)易把雜交種當(dāng)成親本種，造成藥用甘草資源應(yīng)用和研究的混亂，種源不清，質(zhì)量無保障等問題[17]。

本試驗(yàn)以ITS2 為主，psbA-trnH 為輔對(duì)同域分布的藥用甘草物種從分子水平上進(jìn)行種類鑒別，旨在為藥用甘草新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)收集了烏拉爾甘草（ura-N）、脹果甘草（inf-A）、光果甘草（gla-A）、脹果光果雜種甘草（G-A）4 類甘草種共20 個(gè)樣本硅膠干燥葉片，其中，烏拉爾甘草樣本5 個(gè)，采集于新疆尼勒古縣；脹果甘草、光果甘草以及脹果光果雜種甘草樣本分別5 個(gè)，采集于新疆阿拉爾。4 類甘草種樣本的形態(tài)略有不同，烏拉爾甘草復(fù)葉長1.50～4.10 cm，葉緣稍皺或平坦，小葉數(shù)2～8 片；脹果甘草復(fù)葉長1.50～4.10 cm，葉緣皺，小葉數(shù)3～7 片；光果甘草復(fù)葉長4.25～12.40 cm，葉緣平滑，小葉數(shù)9～15 片；脹果光果雜種甘草復(fù)葉長5.50～12.00 cm，葉緣微皺，小葉數(shù)5～11 片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA 提取 本試驗(yàn)采用改良的CTAB 法[18]提取樣本DNA。取0.020 0 g 干燥葉樣在液氮中研磨成粉末，將其置于1.5 mL 離心管中，加入預(yù)熱至65 ℃的CTAB 提取緩沖液1 mL、β－巰基乙醇1 μL，混勻，放入65 ℃水浴鍋中水浴1 h，期間需上下顛倒3～4 次。水浴后冷卻至室溫，10 000 r/min 離心7 min，取上清液并加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，顛倒數(shù)次，12 000 r/min離心5 min；再次取上清液加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提，顛倒數(shù)次，12 000 r/min 離心10 min；取上清液加入2.5 倍體積無水乙醇，倒置數(shù)次，置-20 ℃冷凍30 min，8 000 r/min 離心5 min，挑出的絮狀沉淀，用70%的酒精清洗2 次，室溫晾干至無酒精味。用50 μL 的TE 溶解，即為DNA 模板。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 根據(jù)《中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》[12]進(jìn)行ITS2 序列和psbA-trnH序列的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序[19]如表1 所示。取5 μL 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，恒壓100 V，30 min 左右，用紫外凝膠成像儀觀察并切割目標(biāo)條帶進(jìn)行測(cè)序（由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序后的序列經(jīng)CExpress 軟件序列拼接、校對(duì)，導(dǎo)入到DNAMAN 軟件中獲取多序列比對(duì)圖；在MEGA 7.0 軟件上進(jìn)行全局比對(duì)，比對(duì)后的序列統(tǒng)計(jì)GC 含量，同時(shí)采用Kimura 2-parameter（K2P）計(jì)算遺傳距離，并基于鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，NJ 樹各分支的置信度用boot-strap text 作1 000 次可信度分析。

表1 PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

通過CTAB 法對(duì)所有藥用甘草樣本進(jìn)行DNA提取，利用超微量核算蛋白測(cè)定儀對(duì)樣本DNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，得各樣本DNA 的A260/A280值范圍為1.64～2.05，符合DNA 純度質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，結(jié)果顯示，ITS2 序列擴(kuò)增產(chǎn)物條帶范圍在400～500 bp（圖1），psbA-trnH 序列擴(kuò)增產(chǎn)物條帶約500 bp（圖2），目標(biāo)片段均與預(yù)期相符。

2.2 ITS2 及psbA-trnH 序列變異分析

利用軟件MEGA 7.0 對(duì)ITS2 及psbA-trnH 序列進(jìn)行堿基信息統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，ITS2 序列保守位點(diǎn)有217個(gè)，變異位點(diǎn)為6 個(gè)，變異率為2.69%，簡約信息位點(diǎn)有3 個(gè)；psbA-trnH 序列保守位點(diǎn)有216 個(gè)，變異位點(diǎn)184 個(gè)，變異率為43.60%，簡約信息位點(diǎn)有59 個(gè)。

利用DNAMAN 對(duì)ITS2 和psbA-trnH 進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖3 所示，4 類甘草屬植物在ITS2序列16～18 bp 位點(diǎn)處，烏拉爾甘草樣本多為TGC（除烏拉爾甘草3 號(hào)堿基變?yōu)镃AC 外），脹果甘草、光果甘草及脹果光果雜種甘草在此處均為CAA；在30、89、102 bp 處脹果甘草9 號(hào)與其他脹果甘草樣本相比均存在變異，分別為C-A、C-T、A-T；psbAtrnH 序列中，4 類甘草屬植物變異位點(diǎn)較多（圖4），在245～249、303～305 bp 均存在堿基缺失（圓圈），只有光果gla-A3 為CGTAC、TAC，在228～232 bp 位點(diǎn)處其他序列多為ATCAG，gla-A3 為TAATC（方框），在348～351 bp 處其余光果樣本多為AAGT，而gla-A3 為ACAG（方框）；在脹果甘草和雜交種中，inf-A9 和G-A14 存在多個(gè)位點(diǎn)變異（短橫線）。此外，在330 bp 位點(diǎn)處烏拉爾甘草和光果甘草堿基多為G，脹果甘草與脹果光果雜種甘草為A。

2.3 基于ITS2 及psbA-trnH 序列種內(nèi)種間遺傳距離分析

表2 甘草屬各種間、種內(nèi)遺傳距離

由表2 可知，ITS2 序列中，烏拉爾甘草與光果、脹果、脹果光果雜種甘草的種間遺傳距離分別是0.014 5、0.011 8、0.011 8，均大于種內(nèi)遺傳距離和其他種間遺傳距離；脹果甘草與光果甘草、脹果光果雜種甘草的種間遺傳距離均為0.002 7，顯著小于種內(nèi)遺傳距離。psbA-trnH 序列中，脹果光果雜種甘草雜種與烏拉爾甘草、光果、脹果的種間遺傳距離分別為0.110 1、0.111 0、0.110 8，且均小于種內(nèi)遺傳距離；脹果與烏拉爾甘草、光果的種間遺傳距離為0.077 5、0.078 5，且均小于種內(nèi)遺傳距離?？赡芘cinf-A9 和G-A14 的變異位點(diǎn)較多有關(guān)。

2.4 ITS2 及psbA-trnH 序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用MEGA 7.0 軟件對(duì)樣本的ITS2 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5 所示，系統(tǒng)發(fā)育樹基本分為兩大支，其中，烏拉爾甘草單獨(dú)聚為一支；脹果甘草，光果甘草，光果脹果雜種甘草聚為另一支，說明ITS2 可將烏拉爾甘草與脹果甘草、光果甘草、光果脹果雜種甘草區(qū)分開來。

利用MEGA 7.0 軟件對(duì)樣本的psbA-trnH 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如6 所示，NJ 樹基本分為2 個(gè)大支，其中，光果脹果雜種甘草與脹果甘草聚為一支；烏拉爾甘草與光果甘草聚為另一支。表明光果脹果雜種甘草的遺傳背景偏向于脹果甘草，烏拉爾甘草與光果甘草的親緣關(guān)系較近。

2.5 ITS2 及psbA-trnH 序列的GC 含量分析

通過MEGA 7.0 軟件對(duì)藥用甘草ITS2 和psbA-trnH 序列的GC 含量進(jìn)行分析，結(jié)果如表3 所示，ITS2 序列長度均為223 bp，烏拉爾甘草的GC平均含量為53.36%，與光果甘草、脹果甘草及光果脹果雜種甘草的GC 含量差異分別為0.45、0.45、0.63 百分點(diǎn)。psbA-trnH 序列長度在384～407 bp，脹果光果雜種甘草與脹果甘草之間的GC 含量差異最大，為3.70 百分點(diǎn)，與烏拉爾甘草之間的GC含量差異次之，為3.61 百分點(diǎn)，與光果甘草之間差異為2.91 百分點(diǎn)。

表3 ITS2 和psbA-trnH 序列的GC 含量分析

3 結(jié)論與討論

利用條形碼序列ITS2 和psbA-trnH 進(jìn)行物種鑒定是現(xiàn)代藥用植物鑒定中的常用手段，袁俊杰等[20]利用種間K2P 距離和系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)10 種蒼耳屬雜草的鑒定表明，ITS 和psbA-trnH 序列是鑒別蒼耳屬雜草較理想的條形碼。趙海等[21]以psbA-trnH為主、ITS2 為輔，對(duì)黔太子參2 個(gè)人工選育品種黔太子參1 號(hào)和太子參豐抗1 號(hào)進(jìn)行了明確鑒定。本試驗(yàn)利用ITS2 和psbA-trnH 序列對(duì)烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草和脹果光果雜種甘草進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，在ITS2 序列16～18 bp 位點(diǎn)處烏拉爾甘草堿基為TGC，脹果甘草、光果甘草、脹果光果雜種甘草均為CAA，可將烏拉爾甘草與其他3 類甘草屬植物區(qū)分開，這與郝杰等[10]基于ITS2序列的藥用甘草親緣關(guān)系鑒定研究的結(jié)果一致；psbA-trnH 在330 bp 處烏拉爾甘草和光果甘草堿基為G，脹果甘草與脹果光果雜種甘草在此位點(diǎn)處為A，可將脹果甘草與光果甘草分開，這與楊瑞等[4]利用ITS 和psbA-trnH 變異位點(diǎn)對(duì)不同基原甘草的分子鑒定及市售甘草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)所得的結(jié)果相似。ITS2 序列16～18 bp 和psbA-trnH 序列330 bp 位點(diǎn)可以作為3 類已知甘草屬物種的鑒別位點(diǎn)。而脹果甘草與脹果光果雜種甘草親緣關(guān)系較近，需要補(bǔ)充其他序列進(jìn)一步分析鑒定。

有研究發(fā)現(xiàn)，物種間的GC 含量差異可反映其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，蔡秀珍[22]利用ITS 序列中外類群海芋與內(nèi)類群芋屬植物的GC 含量相差不到1%，得出海芋屬和芋屬是2 個(gè)親緣關(guān)系較近的類群。王丹等[23]通過ITS 序列中綠藻門植物TLD2A1 同其小球藻屬的物種比對(duì)發(fā)現(xiàn)，二者之間GC 含量差異不足1.4%，得出二者親緣關(guān)系較近。本試驗(yàn)通過對(duì)烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草及脹果光果雜種甘草ITS2 序列的GC 含量差異分析可知，烏拉爾甘草與其余材料的GC 含量差異最大，與遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果保持一致。但是psbA-trnH 序列的GC 含量差異分析顯示，脹果甘草與光果甘草GC含量差異為0.79 百分點(diǎn)，說明二者之間親緣關(guān)系較近，這可能與同域分布、自然居群中存在種間雜交基因滲透有關(guān)[24]。在psbA-trnH 序列中，光果脹果雜種甘草與光果甘草和脹果甘草之間的GC 含量差異分別為2.91、3.70 百分點(diǎn)，說明光果脹果雜種甘草與光果甘草的親緣關(guān)系較近，而系統(tǒng)發(fā)育樹中可見光果脹果雜種甘草與脹果甘草聚為一大支。出現(xiàn)此差異可能因?yàn)橐皇莗sbA-trnH 序列較其他葉綠體序列變異率較高，植物分化時(shí)葉綠體基因組中G、C 位點(diǎn)相對(duì)于A、T 位點(diǎn)更容易發(fā)生突變[25]；二是各物種分化后顯著的生活環(huán)境差異影響（A＋T）/（G＋C）的值[26]；三是psbA-trnH 序列為葉綠體基因，遵循細(xì)胞質(zhì)遺傳，在世代雜交過程偏離孟德爾分離[27]，導(dǎo)致ITS2 和psbA-trnH 序列GC 含量分析結(jié)果出現(xiàn)差異。因此，序列的GC 含量與藥用甘草的親緣關(guān)系是否存在必然聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)利用ITS2 和psbA-trnH 對(duì)20 個(gè)藥用甘草樣本進(jìn)行分子鑒定，通過分析各序列的堿基信息、變異位點(diǎn)、系統(tǒng)發(fā)育樹及GC 含量，得出ITS2 序列長223 bp，可從中區(qū)分烏拉爾甘草；psbA-trnH 序列長度為384～407 bp，可進(jìn)一步將光果甘草區(qū)分。表明以ITS2 序列為主、psbA-trnH 序列為輔的鑒定體系具有良好的鑒定能力，但此鑒定體系無法將脹果甘草與光果脹果雜種甘草區(qū)分開，更精準(zhǔn)的鑒定仍需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。本試驗(yàn)研究結(jié)果結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定將為藥用甘草的種類鑒定提供雙重保障。