溫針灸、謝氏點(diǎn)穴及其聯(lián)合治療對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的作用機(jī)制研究

謝林林，趙玉粒，陳 輝，鐘振東，劉益如，龐顯倫

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)典中醫(yī)診療中心，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院老年科，四川 瀘州 646000；3.四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院健康管理中心，四川 瀘州 646000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是以膝關(guān)節(jié)軟骨退行性變化和關(guān)節(jié)表面邊緣形成新骨為主要特征的關(guān)節(jié)退行性疾病。KOA有多種危險(xiǎn)因素，包括遺傳易感性、性別、年齡和肥胖等，其中肥胖所致膝關(guān)節(jié)負(fù)荷增加是KOA的一項(xiàng)重要危險(xiǎn)因素。關(guān)節(jié)過(guò)度負(fù)荷增加了關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)械磨損，負(fù)載異常也可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達(dá)并抑制膠原蛋白的合成。關(guān)節(jié)的過(guò)度負(fù)載除了直接影響軟骨基質(zhì)的合成與降解外，也可誘導(dǎo)促炎因子白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖所致的KOA不僅局限于承重的膝關(guān)節(jié)，還能夠誘導(dǎo)肘關(guān)節(jié)與指關(guān)節(jié)的病變，因此關(guān)節(jié)過(guò)度負(fù)荷并不能完全解釋KOA與肥胖之間的關(guān)系。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂與KOA的發(fā)生密切相關(guān)。脂肪組織是機(jī)體的一種內(nèi)分泌器官，參與各種脂肪因子和細(xì)胞因子的分泌，當(dāng)脂質(zhì)代謝紊亂時(shí)可促進(jìn)全身性的低度炎癥。大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，針灸對(duì)KOA具有較好的療效，但針灸治療KOA的作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究通過(guò)觀察溫針灸、謝氏點(diǎn)穴及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠KOA與脂質(zhì)代謝的影響，探討溫針灸和謝氏點(diǎn)穴治療KOA的可能作用機(jī)制，為針灸治療該病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性健康SD大鼠50只，10周齡，體質(zhì)量為(205±5)g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2020-030；使用許可證號(hào)：SYXK(川)2019-189]，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在該公司進(jìn)行。 標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與材料 IL-1β(ml037361)、TNF-α(ml002859)、MCP-1(ml002960)和VEGF(ml002862) ELISA檢測(cè)試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；全自動(dòng)生化分析儀(Au2700)：日本奧林巴斯；0.22 mm×0.25 mm太和牌針灸針(AN0004)：中國(guó)蘇州；MMP-1(E-AB-60244)和MMP-2(E-AB-40111)兔抗鼠多克隆抗體：Santa Cruz。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠KOA模型的復(fù)制 將50只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、溫針灸治療組、謝氏點(diǎn)穴治療組、溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組，每組10只。模型組、溫針灸治療組、謝氏點(diǎn)穴治療組和溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組大鼠均給予高脂飲食喂養(yǎng)，脂肪占總焦耳數(shù)的65%；給予對(duì)照組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，脂肪占總能量的10%。高脂飼料配方：0.5%膽汁鹽，1%膽固醇，5%蔗糖，15%蛋黃粉，18%豬油，60.5%基礎(chǔ)飼料。所有動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，每?jī)芍軠y(cè)量1次體質(zhì)量。飼養(yǎng)8周后，剔除高脂飼料喂養(yǎng)的各組中體質(zhì)量低于對(duì)照組平均體質(zhì)量20%的大鼠，剩余大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食，12周后進(jìn)行針灸治療。

2.2 針灸干預(yù)方法 溫針灸治療：溫針以膝三針(犢鼻、梁丘、血海)為主穴，輔以足三里和三陰交。謝氏點(diǎn)穴治療：以犢鼻、梁丘、血海為主穴，輔以陽(yáng)陵泉和承山穴。溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療：以犢鼻、梁丘、血海為主穴，同時(shí)輔以足三里、三陰交、陽(yáng)陵泉和承山四穴。針刺前，采用自制固定裝置仰臥位固定大鼠，使膝關(guān)節(jié)呈45°彎曲，75%乙醇無(wú)菌操作后，采用0.22 mm×0.25 mm一次性針灸針，每穴刺入3～5 mm，得氣后將艾粒置于針柄，從下端點(diǎn)燃艾粒，每穴每次灸2壯，燃盡起針，每天1次，連續(xù)治療2周。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 血脂四項(xiàng)的檢測(cè) 針灸治療結(jié)束后2 d，禁食12 h后處死所有大鼠，股動(dòng)脈采血，分離血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(total triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)與低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的含量。

2.3.2 膝關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子的檢測(cè) 將大鼠處死后，沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)暴露出膝關(guān)節(jié)，沿髕骨上緣約向下切割直至股骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨，打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔，用1 mL無(wú)菌PBS灌洗關(guān)節(jié)腔留取關(guān)節(jié)滑液，離心后取上清。采用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1和VEGF的含量。

2.3.3 番紅O/固綠染色與Mankin評(píng)分 剝離大鼠皮膚肌肉，將右側(cè)膝關(guān)節(jié)從股骨髁上1 cm至脛骨平臺(tái)下1 cm完整取下，剔除肌肉組織。膝關(guān)節(jié)依次進(jìn)行固定、脫鈣、脫水、包埋、制片和番紅O/固綠染色，封片后觀察膝關(guān)節(jié)病變，并參照Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)軟骨組織病變進(jìn)行評(píng)估。軟骨組織結(jié)構(gòu)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常，計(jì)0分；表面不平整，計(jì)1分；血管翳及表層破壞，計(jì)2分；裂隙達(dá)移行層，計(jì)3分；裂隙達(dá)輻射層，計(jì)4分；裂隙達(dá)鈣化層，計(jì)5分；全層軟骨缺失，計(jì)6分。軟骨細(xì)胞數(shù)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常，計(jì)0分；增多或排列紊亂，計(jì)1分；成簇狀，計(jì)2分；減少，計(jì)3分。潮線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：完整，計(jì)0分；多重，計(jì)1分；軟骨下骨血管入侵潮線，計(jì)2分。

2.3.4 膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-1與MMP-13免疫組織化學(xué)染色 膝關(guān)節(jié)切片脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)，在4 ℃環(huán)境中分別孵育大鼠MMP-1單克隆抗體與MMP-13單克隆抗體16 h；次日使用DAB免疫組織化學(xué)試劑盒按說(shuō)明書操作進(jìn)行染色后脫水封片。使用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨層免疫組織化學(xué)染色的平均吸光度(optical density，OD)值以及檢測(cè)區(qū)域面積，以O(shè)D值與檢測(cè)區(qū)面積的比值表示MMP-1和MMP-13的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量與血清TC、TG、HDL、LDL水平比較 飼喂14周后高脂飲食大鼠的體質(zhì)量顯著高于普通飲食大鼠(

P

<0.05)，經(jīng)過(guò)兩周的針灸干預(yù)治療，各治療組大鼠體質(zhì)量與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL水平均顯著增高(

P

<0.05)，HDL水平顯著降低(

P

<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠血清TC、TG水平明顯降低(

P

<0.05)，謝氏點(diǎn)穴、溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組HDL水平顯著升高(

P

<0.05)，溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組LDL水平明顯降低(

P

<0.05)；溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組大鼠血清TC、TG、LDL水平均顯著低于溫針灸治療組及謝氏點(diǎn)穴組(

P

<0.05)，HDL水平顯著高于溫針灸治療組(

P

<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 針灸干預(yù)2周后各組大鼠體質(zhì)量比較

3.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理變化比較 與對(duì)照組大鼠相比，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，表層軟骨細(xì)胞排列紊亂，潮線斷裂，有血管通過(guò)，軟骨層缺失受損并深達(dá)骨質(zhì)鈣化負(fù)重區(qū)。溫針灸和謝氏點(diǎn)穴治療組的軟骨表面較完整，軟骨細(xì)胞排列較緊密，潮線缺失情況較輕，但軟骨基質(zhì)部分有局部缺損；溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組軟骨表面完整，軟骨細(xì)胞排列緊密，潮線完整，基質(zhì)完整。見(jiàn)圖1。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin得分顯著高于對(duì)照組(

P

<0.05)；各治療組Mankin得分顯著低于模型組(

P

<0.05)，且溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組Mankin得分顯著低于溫針灸治療組和謝氏點(diǎn)穴治療組(

P

<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL水平比較

3.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1、VEGF水平均顯著增加(

P

<0.05)。與模型組比較，溫針灸治療組膝關(guān)節(jié)滑液MCP-1、VEGF水平顯著降低(

P

<0.05)，謝氏點(diǎn)穴治療組TNF-α、MCP-1、VEGF水平均顯著降低(

P

<0.05)，溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組IL-1β、TNF-α、MCP-1、VEGF水平均顯著降低(

P

<0.05)；溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組IL-1β顯著低于謝氏點(diǎn)穴治療組，TNF-α水平顯著高于謝氏點(diǎn)穴組(

P

<0.05)，MCP-1水平顯著高于溫針灸治療組(

P

<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin得分比較

3.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層中MMP-1、MMP-13表達(dá)水平比較 通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層中MMP-1與MMP-13的表達(dá)水平。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層中出現(xiàn)大量MMP-1、MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞，與模型組相比，溫針灸點(diǎn)穴治療組、謝氏點(diǎn)穴治療組和溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組的MMP-1、MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少。見(jiàn)圖2。平均OD值分析結(jié)果表明，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層中MMP-1、MMP-13表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(

P

<0.05)；與模型組比較，各治療組MMP-13表達(dá)水平均顯著降低(

P

<0.05)，謝氏點(diǎn)穴治療組、溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組MMP-1表達(dá)水平顯著降低(

P

<0.05)；溫針灸+謝氏點(diǎn)穴治療組MMP-1、MMP-13表達(dá)水平均顯著低于溫針灸治療組和謝氏點(diǎn)穴治療組(

P

<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子水平比較

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層中MMP-1、MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果(免疫組織化學(xué)染色，10×40倍)

表5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層中MMP-1、MMP-13表達(dá)水平比較

4 討論

KOA的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，KOA與多種代謝綜合征有關(guān)，并且肥胖所致的脂質(zhì)代謝異常是KOA發(fā)病的一個(gè)重要誘因。Collins等研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高脂飲食飼喂能夠誘發(fā)大鼠的膝骨關(guān)節(jié)炎癥損傷，并且肥胖誘導(dǎo)的KOA與脂肪組織表達(dá)的炎癥循環(huán)因子增加有關(guān)。脂質(zhì)代謝紊亂與慢性炎癥已成為肥胖相關(guān)KOA的研究熱點(diǎn)，但有關(guān)針灸對(duì)肥胖誘導(dǎo)的KOA作用的報(bào)道較少。本研究旨在觀察溫針灸與謝氏點(diǎn)穴及其聯(lián)合治療對(duì)肥胖大鼠脂質(zhì)代謝、膝關(guān)節(jié)損傷、炎癥因子以及關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中MMP-1、MMP-13表達(dá)的影響，探討溫針灸和謝氏點(diǎn)穴治療肥胖相關(guān)KOA可能的作用機(jī)制。

脂質(zhì)代謝紊亂是誘發(fā)KOA的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，血清TC、TG、LDL增加，HDL減少是肥胖脂質(zhì)代謝紊亂的主要特點(diǎn)。Triantaphyllidou等發(fā)現(xiàn)，HDL缺乏小鼠與正常小鼠相比，更易患KOA，其骨髓中脂肪細(xì)胞顯著增加，而骨髓脂肪細(xì)胞可能通過(guò)分泌脂肪因子和炎癥細(xì)胞因子等參與關(guān)節(jié)軟骨的破壞。de Munter等研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇飲食不僅促進(jìn)小鼠滑膜巨噬細(xì)胞的活化，也能促進(jìn)載脂蛋白在滑膜巨噬細(xì)胞中的累積和對(duì)氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)的攝取，從而激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)超家族的生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)性KOA動(dòng)物滑膜和骨贅形成增加。脂質(zhì)代謝紊亂后產(chǎn)生的Ox-LDL能夠刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞釋放VEGF，從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中MMPs、IL-lβ、IL-6和TNF-α的表達(dá)。Ox-LDL也可通過(guò)激活滑膜中巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和趨化因子(如MCP-1)，從而刺激單核細(xì)胞流入，加重膝骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。因此，脂質(zhì)代謝紊亂是促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膝骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要誘因。

中醫(yī)學(xué)將KOA歸屬于“痹證”范疇。痹證是由于氣血阻滯、痰瘀聚集所致，而腎肝脾虧虛為痹證之本。飲食不節(jié)、嗜食肥甘則損傷脾胃，導(dǎo)致濕熱和痰濁內(nèi)生，痰濕又可導(dǎo)致氣滯，而脂積瘀阻，又使氣機(jī)壅滯，從而形成惡性循環(huán)。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期飼喂高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂的同時(shí)，其膝關(guān)節(jié)軟骨缺失、基質(zhì)受損嚴(yán)重，關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1以及VEGF的分泌增多，并且膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1和MMP-13的表達(dá)也顯著增加，具有典型的KOA病理特征，說(shuō)明肥胖是誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎癥損傷的一個(gè)重要誘因。針灸通過(guò)作用病變部位周圍穴位，并與循經(jīng)遠(yuǎn)端取穴相配合，按照“補(bǔ)其不足”“瀉其有余”的治療原則，諸穴配合，氣至病所，以達(dá)到行氣活血、疏經(jīng)通絡(luò)的作用。足三里、三陰交、陽(yáng)陵泉與承山穴常用于治療肥胖相關(guān)疾病，已被證實(shí)可健脾胃、益精氣、除濕祛痰，具有減肥調(diào)脂的雙重作用。在本研究中，溫針灸與謝氏點(diǎn)穴均以犢鼻、梁丘、血海三穴為主穴，溫針灸輔以足三里與三陰交二穴，謝氏點(diǎn)穴則輔以陽(yáng)陵泉與承山二穴，以健運(yùn)脾胃之氣。溫針灸、謝氏點(diǎn)穴及其聯(lián)合治療均可降低肥胖大鼠關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1和MMP-13的表達(dá)水平以及Mankin得分，但溫針灸與謝氏點(diǎn)穴并不能顯著減少肥胖大鼠膝關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、TNF-α、MCP-1和VEGF的分泌，而溫針灸與謝氏點(diǎn)穴聯(lián)合治療則能顯著降低MCP-1和VEGF的水平，說(shuō)明溫針灸輔以足三里與三陰交，或謝氏點(diǎn)穴輔以陽(yáng)陵泉與承山雖能抑制軟骨細(xì)胞MMP-1和MMP-13的表達(dá)，但不能有效抑制膝關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，而溫針灸與謝氏點(diǎn)穴的聯(lián)合則能有效抑制膝骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。

抑制脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的脂肪異位沉積和Ox-LDL的產(chǎn)生，是肥胖導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎癥損傷的主要原因。在本研究中，溫針灸、謝氏點(diǎn)穴及其聯(lián)合治療雖然不能降低肥胖大鼠的體質(zhì)量，但能夠顯著降低血清中TC與TG的含量，而溫針灸與謝氏點(diǎn)穴聯(lián)合使用不僅顯著增加血清HDL的含量，也降低血清LDL的含量，說(shuō)明在犢鼻、梁丘、血海的基礎(chǔ)上輔以足三里、三陰交、陽(yáng)陵泉與承山能夠有效調(diào)節(jié)肥胖KOA大鼠的脂質(zhì)代謝。HDL能與膽固醇酯結(jié)合形成HDL-C，并逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇至肝臟，從而減少脂質(zhì)的異位沉積，而LDL不僅能與膽固醇結(jié)合形成LDL-C，促進(jìn)脂質(zhì)的肝外轉(zhuǎn)運(yùn)，也能被氧化成Ox-LDL。因此，筆者認(rèn)為溫針與謝氏點(diǎn)穴的聯(lián)合能夠通過(guò)增加HDL、降低LDL加強(qiáng)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少骨關(guān)節(jié)中脂質(zhì)沉積和Ox-LDL的產(chǎn)生，從而抑制MCP-1和VEGF的分泌和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而緩解肥胖大鼠的KOA癥狀。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溫針灸與謝氏點(diǎn)穴能夠緩解肥胖大鼠脂質(zhì)代謝紊亂所致膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，減少關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1和MMP-13的表達(dá)水平。選穴輔以足三里、三陰交、陽(yáng)陵泉與承山穴可降低肥胖大鼠血清中TC和TG的含量，聯(lián)合諸穴能夠顯著改善肥胖大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)，通過(guò)增加血清中HDL的含量和降低LDL的含量減少脂質(zhì)異位沉積對(duì)軟骨細(xì)胞的刺激，從而減少關(guān)節(jié)滑液中VEGF與MCP-1的分泌，抑制肥胖誘導(dǎo)的KOA。