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    青枯雷爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)hrcN基因的功能分析

    2021-02-23 05:34:00周大祥龍泉洲殷幼平
    中國生物防治學報 2021年6期
    關(guān)鍵詞:基因突變克隆引物

    周大祥,龍泉洲,殷幼平,熊 書

    (1.重慶大學生命科學學院/重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室,重慶 400300;2.重慶三峽學院生物與食品工程學院,萬州404120;3.重慶三峽醫(yī)藥高等??茖W?;A(chǔ)醫(yī)學部,萬州 404120)

    青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種廣泛分布的土傳病原細菌,能夠侵染50多個科,200多種植物,在全球范圍內(nèi)能夠?qū)е轮卮蟮慕?jīng)濟損失[1]。由該菌引起的青枯病最早于1864年在煙草中報道,它的起源和早期傳播仍未確定。青枯雷爾氏菌能夠在潮濕的土壤或水體中存活數(shù)年[2],當遭遇易感宿主,青枯雷爾氏菌就會進入植物根部,在根部皮層定殖,然后入侵木質(zhì)部導管,最終通過導管系統(tǒng)迅速擴展到植物地上部,在宿主體內(nèi)大量增殖引起導管堵塞與功能紊亂,出現(xiàn)萎焉癥狀。

    hrcN基因作為植物病原菌T3SS結(jié)構(gòu)基因之一,表達產(chǎn)物為ATP酶(ATPase),通過催化ATP的水解為效應蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP產(chǎn)生的能量重塑多種蛋白底物,因此在膜融合、蛋白質(zhì)修飾和降解等許多生理活動中發(fā)揮重要的作用[3]。Pozidis等[4]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas syringas的HrcN是一種定位于外周膜上的ATP酶,能催化蛋白質(zhì)易位。與其他T3SS相關(guān)的ATP酶一樣,HrcN與F0/F1-ATPase亞基同源,包含介導ATP結(jié)合和水解的Walker框[5]。由于T3SS分子伴侶不能被分泌或轉(zhuǎn)運,必須在效應蛋白分泌前從分子伴侶-效應蛋白復合體中釋放出來,這種作用是由T3SS相關(guān)的ATP酶(InvC和HrcN)以ATP依賴的方式進行的。這些ATP酶也作為T3SS效應蛋白的去折疊酶發(fā)揮作用,使效應蛋白保持未折疊或部分未折疊的構(gòu)象[6]。最近Gan等[7]研究發(fā)現(xiàn)T3SS效應蛋白的分泌和轉(zhuǎn)位依賴于分子伴侶HpaB的C端區(qū)域,其C-端區(qū)域的缺失極大的減少了從HpaB與T3SS效應蛋白復合物中釋放出游離效應蛋白的數(shù)量,其中,HrcN以ATP依賴的方式催化該反應。蛋白互作研究顯示,HrcN與T3SS底物特異性開關(guān)蛋白HpaC以及分子伴侶HpaB相互作用,促進多種效應蛋白的分泌[8]。研究還發(fā)現(xiàn)HrcN可與HrcU和HrcV內(nèi)膜蛋白互作[9]。

    前期在擴增出青枯雷爾氏菌hrcN基因序列基礎(chǔ)上,比對發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因與假單胞菌Pseudomonas syringas1448A、黃單胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和細菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性較高,其中與細菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷爾氏菌T3SS基因hrcN為研究對象,利用融合PCR技術(shù)和電轉(zhuǎn)化獲得青枯雷爾氏菌CBM613菌株的hrcN基因突變株和回補菌株,通過測定致病力、生長曲線、運動性檢測和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試菌株與質(zhì)粒:野生型番茄青枯雷爾氏菌CBM613菌株由西南大學植物保護學院饋贈,為強致病力菌株;TOP10化學感受態(tài)細胞購自美國Thermo公司;pMD19-T載體購自日本TAKARA公司;pJQ200SK、pCVD442和pRK415質(zhì)粒載體本實驗室保存。

    供試植物:番茄為感病品種中蔬5號,28 ℃~30 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),光周期16L﹕8D,相對濕度90%,種苗培養(yǎng)至5~6片葉時備用。

    試劑及儀器:NA(Nutrient Agar)培養(yǎng)基(牛肉浸膏3 g,酵母浸膏1 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,瓊脂20 g,蒸餾水加至1000 mL,pH為6.8~7.0)、NB(Nutrient Broth)培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基不加瓊脂)、LB(Lysogeny Broth)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,pH為7.0)、TSB(Tryptic Soy Broth)培養(yǎng)基(胰蛋白胨15 g,大豆蛋白胨5 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,pH為7.2)、Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(KH2PO413.6 g,(NH4)2SO42 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 mg,L-谷氨酸2.9 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,用KOH調(diào)節(jié)pH至7.0)、半固體SMM(Supplemental minimal medium)培養(yǎng)基(葡萄糖0.1 g,蛋白胨0.1 g,EDTA-2Na 38 mg,瓊脂3.5 g,磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)10 mL,加入雙蒸水定容到1000 mL)、CPG(Casamino acids Peptone Glucose)培養(yǎng)基(酵母粉1 g,葡萄糖10 g,牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,pH為7.0);細菌基因組DNA提取試劑盒、細菌質(zhì)粒提取試劑盒購自德國QIAGEN公司;PrimeSTAR Max Premix (2×)購自日本TAKARA公司;TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer購自立陶宛MBI公司;DMSO購自德國Biofroxx公司;其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。5910R高速冷凍離心機,德國eppendorf公司;C1000 PCR儀、核酸電泳儀、Versadoc 1000凝膠成像系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔轉(zhuǎn)化儀,美國BIO-RAD公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 突變株及回補菌株的獲得 參考青枯雷爾氏菌GMI1000hrcN基因設計引物hrcN-F(5′-GGCTGAT ATCGGATCCATGACCCATCTCGCGCTG-3′)和hrcN-R(5′-GGTGGTGGTGCTCGATCATGCCAGTGCG ATCTCGTC-3′)。提取CBM613菌株DNA,PCR擴增。將回收的DNA片段連接到T載體,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,挑取PCR驗證過的陽性克隆菌株測序。利用Krogh等[10]的方法預測分子量、PI、跨膜區(qū)域和親水性;利用深度神經(jīng)網(wǎng)絡SignalP 5.0[11]預測信號肽;利用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw在線比對hrcN的基因和蛋白質(zhì)序列; Motif預測蛋白功能采用Nicolas等[12]的方法;利用http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/GnegmPLoc.cgi 在線預測蛋白亞細胞定位。

    根據(jù)hrcN基因及上下游序列、慶大霉素(Gm)抗性基因序列設計引物(表1),首先擴增出hrcN基因上、下游同源重組臂序列,從pJQ200SK質(zhì)粒上擴增Gm抗性基因編碼序列;然后利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段(hrcN基因上游-Gm-hrcN基因下游),經(jīng)SmaI酶切完成打靶載體pCVD442-ΔhrcN::Gm的構(gòu)建;最后通過同源重組和電轉(zhuǎn)化大腸桿菌,與受菌體(CBM613菌株)結(jié)合,在含Gm的NB培養(yǎng)基上篩選突變株,并用表1中的鑒定引物鑒定突變株。

    表1 hrcN基因敲除所需引物Table 1 Primers used in hrcN gene knockout

    通過hrcN-1F/hrcN-1R擴增出hrcN片段,經(jīng)XbaI/EcoR I酶切后克隆入pRK415質(zhì)粒對應的酶切位點,經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化TOP10化學感受態(tài)細胞后,鋪四環(huán)素(Tc)平板篩選陽性克隆,完成pRK415-hrcN基因回補質(zhì)粒構(gòu)建。回補質(zhì)粒pRK415-hrcN電轉(zhuǎn)化大腸桿菌,與受體菌(CBM613/ΔhrcN)結(jié)合,在含Tc的TSB培養(yǎng)基上篩選回補菌株,用pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR鑒定回補菌株。

    1.2.2 表型測定 番茄感病品種為中蔬5號,按照He等[13]根部接種法接種菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株各接種15株,3次重復。按照Meng等[14]的方法計算青枯病的病情指數(shù);分別挑取3種菌株于NB培養(yǎng)基中,28 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)獲得菌懸液,10000 r/min離心5 min收集菌體。按照Kanda等[15]方法測定600 nm的吸光度值,計算生長曲線;取濃度為3×108CFU/mL的野生型菌株、突變株和回補菌株菌液各5 μL,3種菌株的泳動性檢測按照Kelman等[16]方法測量菌落直徑。3種菌株的生物被膜的測定參考Meng等[17]的方法測定490 nm的吸光度值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 hrcN基因的擴增結(jié)果

    PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳,圖1結(jié)果顯示,條帶清晰而且特異,大小1300 bp左右。將該條帶回收,然后連接到T載體并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌,得到的陽性克隆進行菌落PCR鑒定并測序,測序發(fā)現(xiàn)基因長度為1320 bp,共編碼439個氨基酸,結(jié)果表明已擴增出番茄青枯雷爾氏菌CBM613的hrcN基因,DNA序列已提交到GenBank(Gene ID:No.42594317)。預測HrcN蛋白分子量為47.54 kD,PI為4.97,無信號肽(預測有信號肽概率為1.734%),無跨膜區(qū)域,整體呈弱親水性(圖2)。Motif預測結(jié)果顯示該蛋白為ATP酶,蛋白亞細胞定位預測其定位于細胞內(nèi)膜和細胞質(zhì)。

    圖1 菌株CBM613 hrcN基因的擴增Fig. 1 PCR amplification production of strain CBM613 hrcN gene

    圖2 菌株CBM613 HrcN蛋白親水性預測Fig. 2 Hydrophilicity prediction of HrcN in strain CBM613

    通過與菌株GMI1000的hrcN基因序列進行在線比對發(fā)現(xiàn),該基因一致性為99.6%,在青枯雷爾氏菌中非常保守。青枯雷爾氏菌與參比菌株GMI1000hrcN基因相比共有5個SNP位點,具體突變信息為 216:A-G GTA-GTG val;609:T-C CGT-CGC arg;879:T-C CGT-CGC arg;907:G-A GCC-ACC ala-thr;999:T-C GGT-GGC gly。只有907位氨基酸發(fā)生改變(由GMI1000的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸),其他5個SNP都是無意突變。

    2.2 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建

    突變體篩選的抗性基因采用Gm抗性基因(長度832 bp),hrcN基因上游同源重組臂和下游同源重組臂長度分別為799和742 bp,利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段(上游同源重組臂-Gm抗性基因編碼序列-下游同源重組臂),長度為2373 bp。圖3電泳圖顯示,泳道1中有4條帶,其中最亮的條帶為打靶序列片段,電泳結(jié)果表明成功構(gòu)建了打靶序列片段。

    圖3 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建Fig. 3 Construction of targeting sequence of hrcN gene

    2.3 hrcN基因突變株的構(gòu)建

    將供菌體和受菌體(CBM613菌株)混合結(jié)合后,抗性平板上培養(yǎng)單克隆,隨機挑選 10個單克隆,用hrcN基因內(nèi)部引物進行PCR鑒定。如發(fā)生二次重組,則這對引物無擴增產(chǎn)物,否則有227 bp的特異性擴增條帶。圖4結(jié)果顯示:第1~6號克隆為陰性擴增,表明hrcN基因可能已被敲除;7~10號克隆有227 bp的特異性條帶,說明沒有發(fā)生二次重組,hrcN基因未能成功敲除。

    圖4 菌株CBM613 hrcN突變體內(nèi)部引物鑒定Fig. 4 PCR analysis of hrcN-in of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

    將上述1號克隆再次進行hrcN基因內(nèi)部引物鑒定,為陰性擴增后用hrcN基因外側(cè)引物進行進一步的鑒定。圖5顯示,條帶2為原始菌株的擴增產(chǎn)物長度為2739 bp;條帶1為Gm抗性基因替換菌株的擴增產(chǎn)物長度為2580 bp,同時測序結(jié)果顯示局部序列同設計。該克隆子為最終的hrcN基因被Gm抗性基因替換的陽性克隆,稱為:CBM613/ΔhrcN。

    圖5 菌株CBM613 hrcN突變體外側(cè)引物鑒定Fig. 5 PCR analysis of hrcN-out of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

    2.4 回補菌株的篩選及鑒定

    在Tc平板上的陽性克隆用pRK415-F/pRK415-R載體引物對進行PCR鑒定。當hrcN克隆入設計位點后,這對引物的擴增產(chǎn)物長度為1634 bp。圖6結(jié)果顯示,1~6號全部克隆都有預期長度的特異片段擴增,取第1號克隆的PCR產(chǎn)物進行測序,結(jié)果顯示與設計一致。經(jīng)轉(zhuǎn)化CBM613/ΔhrcN受體菌后,涂布篩選出陽性克隆,pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR擴增,有預期長度的特異片段擴增,表明青枯雷爾氏菌突變株hrcN基因回補成功。

    圖6 hrcN基因回補菌株鑒定Fig. 6 PCR analysis of the complemented strain of hrcN gene

    2.5 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇虏×Φ挠绊?/h3>

    hrcN基因敲除后,在NA培養(yǎng)基上28 ℃生長5 d,突變株和回補菌株菌落形態(tài)與野生型菌株相比無明顯變化(圖7)。進一步將野生型菌株、hrcN基因突變株和回補菌株采用根部接種法接種番茄測定致病力結(jié)果表明,野生型菌株接種番茄植株后,在第4 d開始發(fā)病,突變株在第5 d才開始出現(xiàn)萎蔫癥狀。圖8為野生型菌株、突變株和回補菌株在接種后第7 d的發(fā)病情況可知,野生型菌株的病情指數(shù)為1.87,突變株僅為0.27,下降了85.56%;相比野生型菌株,回補菌株病情指數(shù)為1.67,突變株的致病力能夠部分恢復。接種12 d后,野生型菌株的病情指數(shù)高達3.49,而突變株僅為1.89,回補菌株有所恢復為3.18。接種試驗結(jié)果顯示:突變株較野生型菌株的致病力下降,病程延長,但并未喪失致病力,表明hrcN基因是青枯雷爾氏菌致病性相關(guān)的重要基因。

    圖7 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的菌落形態(tài)Fig. 7 Colony morphology of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and BM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

    圖8 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的致病力測定Fig. 8 Evaluation of the pathogenicity of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

    2.6 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇L曲線的影響

    分別將CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株在Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(貧營養(yǎng)培養(yǎng)基)和 CPG培養(yǎng)基(富營養(yǎng)培養(yǎng)基)中進行生長曲線測定,野生型菌株、突變株和回補菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率差異不明顯(圖9)。

    圖9 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長曲線Fig. 9 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the CPG medium

    3種青枯雷爾氏菌在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后,突變株比野生型菌株生長更快(圖10),生長速率開始出現(xiàn)明顯差異(P<0.05),回補菌株與野生型菌株生長速率無明顯差異。

    圖10 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長曲線Fig. 10 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the mimimal medium

    2.7 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇\動性的影響

    利用半固體SMM培養(yǎng)基,研究CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的運動性。通過測量菌落直徑,野生型菌株、突變株和回補菌株的運動能力沒有顯著差異,結(jié)果表明hrcN基因敲除沒有影響青枯雷爾氏菌的運動性(圖11)。

    圖11 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的運動性Fig. 11 The mobility of of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

    2.8 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇锉荒ば纬赡芰Φ挠绊?/h3>

    通過對比菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的生物被膜形成能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種青枯雷爾氏菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時間增加而增強,突變株相比于野生型菌株,生物被膜形成能力顯著減弱,而回補菌株與野生型菌株相比差異不明顯(圖12)。

    3 討論

    作為植物病原菌分泌毒力因子的重要裝置,分泌系統(tǒng)一直以來都是病原細菌研究的熱點,其中 T3SS在各型分泌系統(tǒng)中研究較多[18]。革蘭氏陰性動植物病原菌利用T3SS將效應蛋白注入真核宿主細胞中,跨膜T3SS裝置和ATP酶有關(guān),ATP酶可為分泌過程提供能量。hrcN基因表達產(chǎn)物為ATP酶,該酶在細菌內(nèi)膜上形成一個與分泌器相關(guān)的環(huán)狀結(jié)構(gòu),并在效應蛋白的分泌過程提供能量,對T3SS和細菌的致病性是必不可少的。hrcN基因敲除后對致病力等表型的影響還未見報道,但與HrcN蛋白具有相同功能的InvC蛋白基因敲除后,突變株較野生型菌株毒力與定殖率皆顯著降低[19]。InvC與大腸桿菌F0/F1-ATPase具有催化功能的β亞基氨基酸序列相似程度很高,invC基因突變后其蛋白水解ATP的能力喪失,突變體分析進一步鑒定出InvC參與核苷酸水解和膜結(jié)合的氨基酸序列[20]。本研究以青枯雷爾氏菌T3SS的hrcN基因為研究對象,該基因是AAA+ATPase家族成員之一,產(chǎn)物為ATP酶。利用同源重組技術(shù)得到了hrcN基因部分缺失突變株,發(fā)現(xiàn)突變株較野生型菌株的致病力下降,病程延長,與青枯雷爾氏菌T3SS效應蛋白基因Rip56敲除后致病力測定結(jié)果相似[21]。結(jié)果表明hrcN是青枯雷爾氏菌的致病基因之一,影響T3SS效應蛋白的分泌。

    接種試驗表明,hrcN基因突變株導致青枯雷爾氏菌對番茄的致病力下降,為了充分研究基因功能,進一步對其生長速率、生物被膜和運動性等基礎(chǔ)生物學特性進行探究。Kanda等[15]測定了煙草青枯雷爾氏菌的生長曲線結(jié)果顯示,不管在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基或者富營養(yǎng)培養(yǎng)基上,野生型菌株與hrpB基因突變株生長速率基本一致。本試驗發(fā)現(xiàn)野生型菌株、hrcN基因突變株和回補菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率基本一致,在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上,hrcN基因突變株比野生型菌株生長更快,這與Kanda等[15]的研究結(jié)論不一致。在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上突變株比野生型菌株生長更快的文獻還未見報道,對番茄青枯雷爾氏菌hrcN基因突變后的代謝是否產(chǎn)生變化尚未可知,需進一步通過組學等技術(shù)探究其原因。

    病原菌通過自身的運動獲得了更大的生存空間,鞭毛等器官可為其提供運動能力。通過運動性病原菌對有利或不利的環(huán)境快速做出響應,避開有害的環(huán)境,接近有利的宿主附近,擴大生存范圍。運動性能夠促使植物病原菌在侵染初期識別、吸附和入侵宿主植物并進行定殖和擴展,提高病原菌的致病能力,而運動性對病原菌入侵植物后的階段不起作用[22]。此次研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因敲除后對番茄青枯雷爾氏菌的運動能力沒有影響,而敲除spoT和relA基因后對青枯雷爾氏菌的運動能力影響很大[23]。

    生物被膜作為保護細菌的生物活性膜,能夠形成在非有機體和有機體的表面。其主要成分為蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)和胞外DNA等,是一種復雜的三維結(jié)構(gòu)。當環(huán)境發(fā)生改變,細菌形成生物被膜可以保持水分,通過調(diào)節(jié)代謝降低營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,從而有助于細菌存活。細菌形成的生物被膜將自身包圍,處于其中的細菌相互彼此接觸,影響許多微生物的生存與定殖,比如植物病原細菌通過昆蟲傳播、直接侵入或從受傷部位入侵植物組織,利用生物被膜增強在植物根、莖、葉和種子等部位的定殖與生存,通過阻塞植物木質(zhì)部導管和維管束組織,引起組織損傷,破壞被感染的組織,造成植物萎蔫。玉米細菌性萎蔫病病原菌Pantoeastewartii、馬鈴薯軟腐病病原菌Pectobacterium carotovorumbrasiliense和油菜黑腐病病原菌Xanthomonas campestris等的生物被膜能夠阻塞植物木質(zhì)部導管和維管束組織,引起組織損傷,破壞被感染的組織,造成植物萎蔫[24-26]。研究還發(fā)現(xiàn),柑橘潰瘍病病原菌Xanthomonas citri的T3SShrpB缺失突變株不能在柑橘葉片表面聚集,喪失生物被膜的形成能力[27],革蘭氏陰性菌Acidovorax citrulli的4個Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因突變株在甜瓜種子上形成生物被膜和定殖的能力降低[28],某些分泌系統(tǒng)與生物被膜形成和細胞聚集有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因突變株相比于野生型菌株,生物被膜形成能力顯著減弱,結(jié)合hrcN基因突變株致病力降低,說明hrcN基因敲除后,番茄青枯雷爾氏菌生物被膜形成能力降低,番茄木質(zhì)部導管阻塞程度減弱,萎蔫減輕,病情指數(shù)降低。本研究為后續(xù)探究青枯菌 T3SS的功能及其致病機制提供基礎(chǔ),研究發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因敲除后菌株毒性減弱,未來可以作為青枯病的生防菌株,具有一定的應用價值。

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