• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    青枯雷爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)hrcN基因的功能分析

    2021-02-23 05:34:00周大祥龍泉洲殷幼平
    中國生物防治學報 2021年6期
    關(guān)鍵詞:基因突變克隆引物

    周大祥,龍泉洲,殷幼平,熊 書

    (1.重慶大學生命科學學院/重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室,重慶 400300;2.重慶三峽學院生物與食品工程學院,萬州404120;3.重慶三峽醫(yī)藥高等??茖W?;A(chǔ)醫(yī)學部,萬州 404120)

    青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種廣泛分布的土傳病原細菌,能夠侵染50多個科,200多種植物,在全球范圍內(nèi)能夠?qū)е轮卮蟮慕?jīng)濟損失[1]。由該菌引起的青枯病最早于1864年在煙草中報道,它的起源和早期傳播仍未確定。青枯雷爾氏菌能夠在潮濕的土壤或水體中存活數(shù)年[2],當遭遇易感宿主,青枯雷爾氏菌就會進入植物根部,在根部皮層定殖,然后入侵木質(zhì)部導管,最終通過導管系統(tǒng)迅速擴展到植物地上部,在宿主體內(nèi)大量增殖引起導管堵塞與功能紊亂,出現(xiàn)萎焉癥狀。

    hrcN基因作為植物病原菌T3SS結(jié)構(gòu)基因之一,表達產(chǎn)物為ATP酶(ATPase),通過催化ATP的水解為效應蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP產(chǎn)生的能量重塑多種蛋白底物,因此在膜融合、蛋白質(zhì)修飾和降解等許多生理活動中發(fā)揮重要的作用[3]。Pozidis等[4]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas syringas的HrcN是一種定位于外周膜上的ATP酶,能催化蛋白質(zhì)易位。與其他T3SS相關(guān)的ATP酶一樣,HrcN與F0/F1-ATPase亞基同源,包含介導ATP結(jié)合和水解的Walker框[5]。由于T3SS分子伴侶不能被分泌或轉(zhuǎn)運,必須在效應蛋白分泌前從分子伴侶-效應蛋白復合體中釋放出來,這種作用是由T3SS相關(guān)的ATP酶(InvC和HrcN)以ATP依賴的方式進行的。這些ATP酶也作為T3SS效應蛋白的去折疊酶發(fā)揮作用,使效應蛋白保持未折疊或部分未折疊的構(gòu)象[6]。最近Gan等[7]研究發(fā)現(xiàn)T3SS效應蛋白的分泌和轉(zhuǎn)位依賴于分子伴侶HpaB的C端區(qū)域,其C-端區(qū)域的缺失極大的減少了從HpaB與T3SS效應蛋白復合物中釋放出游離效應蛋白的數(shù)量,其中,HrcN以ATP依賴的方式催化該反應。蛋白互作研究顯示,HrcN與T3SS底物特異性開關(guān)蛋白HpaC以及分子伴侶HpaB相互作用,促進多種效應蛋白的分泌[8]。研究還發(fā)現(xiàn)HrcN可與HrcU和HrcV內(nèi)膜蛋白互作[9]。

    前期在擴增出青枯雷爾氏菌hrcN基因序列基礎(chǔ)上,比對發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因與假單胞菌Pseudomonas syringas1448A、黃單胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和細菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性較高,其中與細菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷爾氏菌T3SS基因hrcN為研究對象,利用融合PCR技術(shù)和電轉(zhuǎn)化獲得青枯雷爾氏菌CBM613菌株的hrcN基因突變株和回補菌株,通過測定致病力、生長曲線、運動性檢測和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試菌株與質(zhì)粒:野生型番茄青枯雷爾氏菌CBM613菌株由西南大學植物保護學院饋贈,為強致病力菌株;TOP10化學感受態(tài)細胞購自美國Thermo公司;pMD19-T載體購自日本TAKARA公司;pJQ200SK、pCVD442和pRK415質(zhì)粒載體本實驗室保存。

    供試植物:番茄為感病品種中蔬5號,28 ℃~30 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),光周期16L﹕8D,相對濕度90%,種苗培養(yǎng)至5~6片葉時備用。

    試劑及儀器:NA(Nutrient Agar)培養(yǎng)基(牛肉浸膏3 g,酵母浸膏1 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,瓊脂20 g,蒸餾水加至1000 mL,pH為6.8~7.0)、NB(Nutrient Broth)培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基不加瓊脂)、LB(Lysogeny Broth)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,pH為7.0)、TSB(Tryptic Soy Broth)培養(yǎng)基(胰蛋白胨15 g,大豆蛋白胨5 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,pH為7.2)、Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(KH2PO413.6 g,(NH4)2SO42 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 mg,L-谷氨酸2.9 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,用KOH調(diào)節(jié)pH至7.0)、半固體SMM(Supplemental minimal medium)培養(yǎng)基(葡萄糖0.1 g,蛋白胨0.1 g,EDTA-2Na 38 mg,瓊脂3.5 g,磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)10 mL,加入雙蒸水定容到1000 mL)、CPG(Casamino acids Peptone Glucose)培養(yǎng)基(酵母粉1 g,葡萄糖10 g,牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,加入雙蒸水定容到1000 mL,pH為7.0);細菌基因組DNA提取試劑盒、細菌質(zhì)粒提取試劑盒購自德國QIAGEN公司;PrimeSTAR Max Premix (2×)購自日本TAKARA公司;TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer購自立陶宛MBI公司;DMSO購自德國Biofroxx公司;其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。5910R高速冷凍離心機,德國eppendorf公司;C1000 PCR儀、核酸電泳儀、Versadoc 1000凝膠成像系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔轉(zhuǎn)化儀,美國BIO-RAD公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 突變株及回補菌株的獲得 參考青枯雷爾氏菌GMI1000hrcN基因設計引物hrcN-F(5′-GGCTGAT ATCGGATCCATGACCCATCTCGCGCTG-3′)和hrcN-R(5′-GGTGGTGGTGCTCGATCATGCCAGTGCG ATCTCGTC-3′)。提取CBM613菌株DNA,PCR擴增。將回收的DNA片段連接到T載體,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,挑取PCR驗證過的陽性克隆菌株測序。利用Krogh等[10]的方法預測分子量、PI、跨膜區(qū)域和親水性;利用深度神經(jīng)網(wǎng)絡SignalP 5.0[11]預測信號肽;利用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw在線比對hrcN的基因和蛋白質(zhì)序列; Motif預測蛋白功能采用Nicolas等[12]的方法;利用http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/GnegmPLoc.cgi 在線預測蛋白亞細胞定位。

    根據(jù)hrcN基因及上下游序列、慶大霉素(Gm)抗性基因序列設計引物(表1),首先擴增出hrcN基因上、下游同源重組臂序列,從pJQ200SK質(zhì)粒上擴增Gm抗性基因編碼序列;然后利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段(hrcN基因上游-Gm-hrcN基因下游),經(jīng)SmaI酶切完成打靶載體pCVD442-ΔhrcN::Gm的構(gòu)建;最后通過同源重組和電轉(zhuǎn)化大腸桿菌,與受菌體(CBM613菌株)結(jié)合,在含Gm的NB培養(yǎng)基上篩選突變株,并用表1中的鑒定引物鑒定突變株。

    表1 hrcN基因敲除所需引物Table 1 Primers used in hrcN gene knockout

    通過hrcN-1F/hrcN-1R擴增出hrcN片段,經(jīng)XbaI/EcoR I酶切后克隆入pRK415質(zhì)粒對應的酶切位點,經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化TOP10化學感受態(tài)細胞后,鋪四環(huán)素(Tc)平板篩選陽性克隆,完成pRK415-hrcN基因回補質(zhì)粒構(gòu)建。回補質(zhì)粒pRK415-hrcN電轉(zhuǎn)化大腸桿菌,與受體菌(CBM613/ΔhrcN)結(jié)合,在含Tc的TSB培養(yǎng)基上篩選回補菌株,用pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR鑒定回補菌株。

    1.2.2 表型測定 番茄感病品種為中蔬5號,按照He等[13]根部接種法接種菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株各接種15株,3次重復。按照Meng等[14]的方法計算青枯病的病情指數(shù);分別挑取3種菌株于NB培養(yǎng)基中,28 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)獲得菌懸液,10000 r/min離心5 min收集菌體。按照Kanda等[15]方法測定600 nm的吸光度值,計算生長曲線;取濃度為3×108CFU/mL的野生型菌株、突變株和回補菌株菌液各5 μL,3種菌株的泳動性檢測按照Kelman等[16]方法測量菌落直徑。3種菌株的生物被膜的測定參考Meng等[17]的方法測定490 nm的吸光度值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 hrcN基因的擴增結(jié)果

    PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳,圖1結(jié)果顯示,條帶清晰而且特異,大小1300 bp左右。將該條帶回收,然后連接到T載體并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌,得到的陽性克隆進行菌落PCR鑒定并測序,測序發(fā)現(xiàn)基因長度為1320 bp,共編碼439個氨基酸,結(jié)果表明已擴增出番茄青枯雷爾氏菌CBM613的hrcN基因,DNA序列已提交到GenBank(Gene ID:No.42594317)。預測HrcN蛋白分子量為47.54 kD,PI為4.97,無信號肽(預測有信號肽概率為1.734%),無跨膜區(qū)域,整體呈弱親水性(圖2)。Motif預測結(jié)果顯示該蛋白為ATP酶,蛋白亞細胞定位預測其定位于細胞內(nèi)膜和細胞質(zhì)。

    圖1 菌株CBM613 hrcN基因的擴增Fig. 1 PCR amplification production of strain CBM613 hrcN gene

    圖2 菌株CBM613 HrcN蛋白親水性預測Fig. 2 Hydrophilicity prediction of HrcN in strain CBM613

    通過與菌株GMI1000的hrcN基因序列進行在線比對發(fā)現(xiàn),該基因一致性為99.6%,在青枯雷爾氏菌中非常保守。青枯雷爾氏菌與參比菌株GMI1000hrcN基因相比共有5個SNP位點,具體突變信息為 216:A-G GTA-GTG val;609:T-C CGT-CGC arg;879:T-C CGT-CGC arg;907:G-A GCC-ACC ala-thr;999:T-C GGT-GGC gly。只有907位氨基酸發(fā)生改變(由GMI1000的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸),其他5個SNP都是無意突變。

    2.2 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建

    突變體篩選的抗性基因采用Gm抗性基因(長度832 bp),hrcN基因上游同源重組臂和下游同源重組臂長度分別為799和742 bp,利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段(上游同源重組臂-Gm抗性基因編碼序列-下游同源重組臂),長度為2373 bp。圖3電泳圖顯示,泳道1中有4條帶,其中最亮的條帶為打靶序列片段,電泳結(jié)果表明成功構(gòu)建了打靶序列片段。

    圖3 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建Fig. 3 Construction of targeting sequence of hrcN gene

    2.3 hrcN基因突變株的構(gòu)建

    將供菌體和受菌體(CBM613菌株)混合結(jié)合后,抗性平板上培養(yǎng)單克隆,隨機挑選 10個單克隆,用hrcN基因內(nèi)部引物進行PCR鑒定。如發(fā)生二次重組,則這對引物無擴增產(chǎn)物,否則有227 bp的特異性擴增條帶。圖4結(jié)果顯示:第1~6號克隆為陰性擴增,表明hrcN基因可能已被敲除;7~10號克隆有227 bp的特異性條帶,說明沒有發(fā)生二次重組,hrcN基因未能成功敲除。

    圖4 菌株CBM613 hrcN突變體內(nèi)部引物鑒定Fig. 4 PCR analysis of hrcN-in of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

    將上述1號克隆再次進行hrcN基因內(nèi)部引物鑒定,為陰性擴增后用hrcN基因外側(cè)引物進行進一步的鑒定。圖5顯示,條帶2為原始菌株的擴增產(chǎn)物長度為2739 bp;條帶1為Gm抗性基因替換菌株的擴增產(chǎn)物長度為2580 bp,同時測序結(jié)果顯示局部序列同設計。該克隆子為最終的hrcN基因被Gm抗性基因替換的陽性克隆,稱為:CBM613/ΔhrcN。

    圖5 菌株CBM613 hrcN突變體外側(cè)引物鑒定Fig. 5 PCR analysis of hrcN-out of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

    2.4 回補菌株的篩選及鑒定

    在Tc平板上的陽性克隆用pRK415-F/pRK415-R載體引物對進行PCR鑒定。當hrcN克隆入設計位點后,這對引物的擴增產(chǎn)物長度為1634 bp。圖6結(jié)果顯示,1~6號全部克隆都有預期長度的特異片段擴增,取第1號克隆的PCR產(chǎn)物進行測序,結(jié)果顯示與設計一致。經(jīng)轉(zhuǎn)化CBM613/ΔhrcN受體菌后,涂布篩選出陽性克隆,pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR擴增,有預期長度的特異片段擴增,表明青枯雷爾氏菌突變株hrcN基因回補成功。

    圖6 hrcN基因回補菌株鑒定Fig. 6 PCR analysis of the complemented strain of hrcN gene

    2.5 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇虏×Φ挠绊?/h3>

    hrcN基因敲除后,在NA培養(yǎng)基上28 ℃生長5 d,突變株和回補菌株菌落形態(tài)與野生型菌株相比無明顯變化(圖7)。進一步將野生型菌株、hrcN基因突變株和回補菌株采用根部接種法接種番茄測定致病力結(jié)果表明,野生型菌株接種番茄植株后,在第4 d開始發(fā)病,突變株在第5 d才開始出現(xiàn)萎蔫癥狀。圖8為野生型菌株、突變株和回補菌株在接種后第7 d的發(fā)病情況可知,野生型菌株的病情指數(shù)為1.87,突變株僅為0.27,下降了85.56%;相比野生型菌株,回補菌株病情指數(shù)為1.67,突變株的致病力能夠部分恢復。接種12 d后,野生型菌株的病情指數(shù)高達3.49,而突變株僅為1.89,回補菌株有所恢復為3.18。接種試驗結(jié)果顯示:突變株較野生型菌株的致病力下降,病程延長,但并未喪失致病力,表明hrcN基因是青枯雷爾氏菌致病性相關(guān)的重要基因。

    圖7 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的菌落形態(tài)Fig. 7 Colony morphology of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and BM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

    圖8 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的致病力測定Fig. 8 Evaluation of the pathogenicity of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

    2.6 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇L曲線的影響

    分別將CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株在Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(貧營養(yǎng)培養(yǎng)基)和 CPG培養(yǎng)基(富營養(yǎng)培養(yǎng)基)中進行生長曲線測定,野生型菌株、突變株和回補菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率差異不明顯(圖9)。

    圖9 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長曲線Fig. 9 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the CPG medium

    3種青枯雷爾氏菌在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后,突變株比野生型菌株生長更快(圖10),生長速率開始出現(xiàn)明顯差異(P<0.05),回補菌株與野生型菌株生長速率無明顯差異。

    圖10 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長曲線Fig. 10 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the mimimal medium

    2.7 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇\動性的影響

    利用半固體SMM培養(yǎng)基,研究CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的運動性。通過測量菌落直徑,野生型菌株、突變株和回補菌株的運動能力沒有顯著差異,結(jié)果表明hrcN基因敲除沒有影響青枯雷爾氏菌的運動性(圖11)。

    圖11 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的運動性Fig. 11 The mobility of of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

    2.8 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇锉荒ば纬赡芰Φ挠绊?/h3>

    通過對比菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的生物被膜形成能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種青枯雷爾氏菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時間增加而增強,突變株相比于野生型菌株,生物被膜形成能力顯著減弱,而回補菌株與野生型菌株相比差異不明顯(圖12)。

    3 討論

    作為植物病原菌分泌毒力因子的重要裝置,分泌系統(tǒng)一直以來都是病原細菌研究的熱點,其中 T3SS在各型分泌系統(tǒng)中研究較多[18]。革蘭氏陰性動植物病原菌利用T3SS將效應蛋白注入真核宿主細胞中,跨膜T3SS裝置和ATP酶有關(guān),ATP酶可為分泌過程提供能量。hrcN基因表達產(chǎn)物為ATP酶,該酶在細菌內(nèi)膜上形成一個與分泌器相關(guān)的環(huán)狀結(jié)構(gòu),并在效應蛋白的分泌過程提供能量,對T3SS和細菌的致病性是必不可少的。hrcN基因敲除后對致病力等表型的影響還未見報道,但與HrcN蛋白具有相同功能的InvC蛋白基因敲除后,突變株較野生型菌株毒力與定殖率皆顯著降低[19]。InvC與大腸桿菌F0/F1-ATPase具有催化功能的β亞基氨基酸序列相似程度很高,invC基因突變后其蛋白水解ATP的能力喪失,突變體分析進一步鑒定出InvC參與核苷酸水解和膜結(jié)合的氨基酸序列[20]。本研究以青枯雷爾氏菌T3SS的hrcN基因為研究對象,該基因是AAA+ATPase家族成員之一,產(chǎn)物為ATP酶。利用同源重組技術(shù)得到了hrcN基因部分缺失突變株,發(fā)現(xiàn)突變株較野生型菌株的致病力下降,病程延長,與青枯雷爾氏菌T3SS效應蛋白基因Rip56敲除后致病力測定結(jié)果相似[21]。結(jié)果表明hrcN是青枯雷爾氏菌的致病基因之一,影響T3SS效應蛋白的分泌。

    接種試驗表明,hrcN基因突變株導致青枯雷爾氏菌對番茄的致病力下降,為了充分研究基因功能,進一步對其生長速率、生物被膜和運動性等基礎(chǔ)生物學特性進行探究。Kanda等[15]測定了煙草青枯雷爾氏菌的生長曲線結(jié)果顯示,不管在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基或者富營養(yǎng)培養(yǎng)基上,野生型菌株與hrpB基因突變株生長速率基本一致。本試驗發(fā)現(xiàn)野生型菌株、hrcN基因突變株和回補菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率基本一致,在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上,hrcN基因突變株比野生型菌株生長更快,這與Kanda等[15]的研究結(jié)論不一致。在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上突變株比野生型菌株生長更快的文獻還未見報道,對番茄青枯雷爾氏菌hrcN基因突變后的代謝是否產(chǎn)生變化尚未可知,需進一步通過組學等技術(shù)探究其原因。

    病原菌通過自身的運動獲得了更大的生存空間,鞭毛等器官可為其提供運動能力。通過運動性病原菌對有利或不利的環(huán)境快速做出響應,避開有害的環(huán)境,接近有利的宿主附近,擴大生存范圍。運動性能夠促使植物病原菌在侵染初期識別、吸附和入侵宿主植物并進行定殖和擴展,提高病原菌的致病能力,而運動性對病原菌入侵植物后的階段不起作用[22]。此次研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因敲除后對番茄青枯雷爾氏菌的運動能力沒有影響,而敲除spoT和relA基因后對青枯雷爾氏菌的運動能力影響很大[23]。

    生物被膜作為保護細菌的生物活性膜,能夠形成在非有機體和有機體的表面。其主要成分為蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)和胞外DNA等,是一種復雜的三維結(jié)構(gòu)。當環(huán)境發(fā)生改變,細菌形成生物被膜可以保持水分,通過調(diào)節(jié)代謝降低營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,從而有助于細菌存活。細菌形成的生物被膜將自身包圍,處于其中的細菌相互彼此接觸,影響許多微生物的生存與定殖,比如植物病原細菌通過昆蟲傳播、直接侵入或從受傷部位入侵植物組織,利用生物被膜增強在植物根、莖、葉和種子等部位的定殖與生存,通過阻塞植物木質(zhì)部導管和維管束組織,引起組織損傷,破壞被感染的組織,造成植物萎蔫。玉米細菌性萎蔫病病原菌Pantoeastewartii、馬鈴薯軟腐病病原菌Pectobacterium carotovorumbrasiliense和油菜黑腐病病原菌Xanthomonas campestris等的生物被膜能夠阻塞植物木質(zhì)部導管和維管束組織,引起組織損傷,破壞被感染的組織,造成植物萎蔫[24-26]。研究還發(fā)現(xiàn),柑橘潰瘍病病原菌Xanthomonas citri的T3SShrpB缺失突變株不能在柑橘葉片表面聚集,喪失生物被膜的形成能力[27],革蘭氏陰性菌Acidovorax citrulli的4個Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因突變株在甜瓜種子上形成生物被膜和定殖的能力降低[28],某些分泌系統(tǒng)與生物被膜形成和細胞聚集有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因突變株相比于野生型菌株,生物被膜形成能力顯著減弱,結(jié)合hrcN基因突變株致病力降低,說明hrcN基因敲除后,番茄青枯雷爾氏菌生物被膜形成能力降低,番茄木質(zhì)部導管阻塞程度減弱,萎蔫減輕,病情指數(shù)降低。本研究為后續(xù)探究青枯菌 T3SS的功能及其致病機制提供基礎(chǔ),研究發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因敲除后菌株毒性減弱,未來可以作為青枯病的生防菌株,具有一定的應用價值。

    猜你喜歡
    基因突變克隆引物
    大狗,小狗——基因突變解釋體型大小
    英語世界(2023年6期)2023-06-30 06:29:10
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    生物學通報(2022年1期)2022-11-22 08:12:18
    克隆狼
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    管家基因突變導致面部特異性出生缺陷的原因
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    基因突變的“新物種”
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    火炬松SSR-PCR反應體系的建立及引物篩選
    99久久精品国产亚洲精品| 两人在一起打扑克的视频| 国产成人系列免费观看| 午夜影院日韩av| 国产日韩欧美亚洲二区| av天堂在线播放| videos熟女内射| 两个人免费观看高清视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av中文乱码字幕在线| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 在线看a的网站| 视频区欧美日本亚洲| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人精品无人区| 一级作爱视频免费观看| 亚洲avbb在线观看| 人人澡人人妻人| 欧美乱色亚洲激情| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲专区国产一区二区| 91字幕亚洲| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产高清激情床上av| 午夜福利一区二区在线看| 午夜福利在线免费观看网站| 1024视频免费在线观看| 久久精品成人免费网站| 极品人妻少妇av视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品少妇久久久久久888优播| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久中文字幕一级| 国产色视频综合| 久久青草综合色| 国产男女超爽视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品永久免费网站| 韩国av一区二区三区四区| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品一区二区三卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 天天添夜夜摸| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品成人在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品一区二区免费欧美| 一本综合久久免费| 女性被躁到高潮视频| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品综合久久久久久久免费 | 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲黑人精品在线| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜免费鲁丝| 亚洲色图综合在线观看| 美国免费a级毛片| 国产一区二区三区视频了| 国产不卡一卡二| 一区二区日韩欧美中文字幕| videosex国产| 在线观看午夜福利视频| 最新在线观看一区二区三区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 成年人午夜在线观看视频| 悠悠久久av| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 热99国产精品久久久久久7| 热re99久久精品国产66热6| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 村上凉子中文字幕在线| 黄片小视频在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 成年人黄色毛片网站| 婷婷丁香在线五月| 成人影院久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 成年人午夜在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 麻豆乱淫一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 制服诱惑二区| 一级片'在线观看视频| 一级毛片精品| 欧美性长视频在线观看| 国产在线观看jvid| 亚洲精品粉嫩美女一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美乱妇无乱码| 免费在线观看亚洲国产| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一二三四在线观看免费中文在| 身体一侧抽搐| 在线视频色国产色| 日韩欧美三级三区| 天天添夜夜摸| 久久精品亚洲av国产电影网| 一级片'在线观看视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 麻豆成人av在线观看| 男女午夜视频在线观看| 日本欧美视频一区| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲精华国产精华精| 三级毛片av免费| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 日本黄色视频三级网站网址 | 欧美成狂野欧美在线观看| 人妻久久中文字幕网| 91精品国产国语对白视频| 在线观看舔阴道视频| 久久性视频一级片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲av片天天在线观看| 手机成人av网站| 日韩免费av在线播放| 国产在视频线精品| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 下体分泌物呈黄色| 在线观看午夜福利视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 视频在线观看一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 精品久久久久久久久久免费视频 | 99久久精品国产亚洲精品| 精品第一国产精品| 高清欧美精品videossex| 亚洲精品国产区一区二| 国产又爽黄色视频| 成人免费观看视频高清| 一级片免费观看大全| 亚洲欧美激情综合另类| 91大片在线观看| 欧美日韩精品网址| 在线观看一区二区三区激情| 香蕉国产在线看| 久久精品国产综合久久久| 在线观看免费视频网站a站| 久久九九热精品免费| 色综合婷婷激情| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人av教育| 757午夜福利合集在线观看| 美女午夜性视频免费| 亚洲九九香蕉| 乱人伦中国视频| 国产在线一区二区三区精| 国产精品国产av在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 日韩有码中文字幕| 午夜激情av网站| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品欧美亚洲77777| 黄色 视频免费看| 香蕉丝袜av| 免费av中文字幕在线| 老司机靠b影院| 51午夜福利影视在线观看| 制服人妻中文乱码| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美午夜高清在线| 亚洲精品一二三| 久久久国产成人免费| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲精品粉嫩美女一区| 制服人妻中文乱码| 欧美+亚洲+日韩+国产| 最近最新中文字幕大全免费视频| 色综合婷婷激情| 精品人妻在线不人妻| 在线观看日韩欧美| 在线观看66精品国产| 91成年电影在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人精品久久二区二区免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品久久久久久电影网| av免费在线观看网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品永久免费网站| 丁香欧美五月| 国产熟女午夜一区二区三区| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品一区二区在线观看99| 久久久国产一区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美性长视频在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久热这里只有精品99| bbb黄色大片| 欧美精品亚洲一区二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 91精品国产国语对白视频| 久久久精品免费免费高清| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久精品区二区三区| 黄频高清免费视频| 午夜日韩欧美国产| 国产欧美亚洲国产| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 自线自在国产av| a级毛片在线看网站| 精品国产国语对白av| 宅男免费午夜| 多毛熟女@视频| av线在线观看网站| 一级作爱视频免费观看| 国产精品1区2区在线观看. | 午夜日韩欧美国产| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产男女内射视频| 精品久久久久久,| 69精品国产乱码久久久| 久久香蕉精品热| 精品国产乱码久久久久久男人| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 欧美丝袜亚洲另类 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 丝袜美腿诱惑在线| 99国产精品99久久久久| 国产91精品成人一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 国产精品影院久久| 99热国产这里只有精品6| 国产精品免费视频内射| 69av精品久久久久久| 中文字幕高清在线视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品久久电影中文字幕 | 一级作爱视频免费观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 欧美性长视频在线观看| 日韩欧美免费精品| 精品国产国语对白av| 天堂动漫精品| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 夜夜夜夜夜久久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 麻豆av在线久日| 日韩免费高清中文字幕av| 日本黄色日本黄色录像| 91老司机精品| 18禁国产床啪视频网站| 黑人猛操日本美女一级片| 国产野战对白在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 三上悠亚av全集在线观看| 中国美女看黄片| 超碰成人久久| 大陆偷拍与自拍| 黄色怎么调成土黄色| 午夜福利一区二区在线看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文字幕制服av| 亚洲人成电影观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲av片天天在线观看| 久久久久久久午夜电影 | 不卡一级毛片| 国产精品成人在线| 中文亚洲av片在线观看爽 | 欧美 日韩 精品 国产| 最近最新免费中文字幕在线| 水蜜桃什么品种好| 国产成人精品无人区| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产欧美亚洲国产| 免费观看精品视频网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 中文亚洲av片在线观看爽 | 日韩免费av在线播放| 国产精品成人在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 视频区欧美日本亚洲| 黄色a级毛片大全视频| 午夜免费观看网址| av一本久久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲成人免费av在线播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产高清视频在线播放一区| 欧美日韩福利视频一区二区| 中文字幕制服av| tocl精华| 日韩免费高清中文字幕av| 两个人免费观看高清视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 成人18禁在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 黄色视频不卡| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲 欧美一区二区三区| 91成人精品电影| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品久久视频播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产一区二区三区视频了| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品国产综合久久久| 丝袜在线中文字幕| 人妻一区二区av| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久中文看片网| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产淫语在线视频| 亚洲avbb在线观看| av视频免费观看在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产区一区二久久| 丁香欧美五月| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 丁香欧美五月| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人三级做爰电影| 两个人免费观看高清视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久精品免费免费高清| 国产精品免费大片| 国产精品国产av在线观看| 国产精品永久免费网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 高清在线国产一区| 日韩欧美三级三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 91精品国产国语对白视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 大陆偷拍与自拍| 精品久久久精品久久久| 日本a在线网址| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 黄色丝袜av网址大全| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 热99久久久久精品小说推荐| 久久人妻av系列| 午夜福利,免费看| 亚洲在线自拍视频| 成人免费观看视频高清| av电影中文网址| 黄频高清免费视频| 水蜜桃什么品种好| 国产精品成人在线| 三上悠亚av全集在线观看| 女警被强在线播放| 亚洲美女黄片视频| 欧美成人免费av一区二区三区 | 99久久精品国产亚洲精品| 男女午夜视频在线观看| 老司机福利观看| 午夜福利欧美成人| 久久久久精品国产欧美久久久| 1024香蕉在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜福利免费观看在线| 国产免费男女视频| 电影成人av| 少妇 在线观看| 十八禁人妻一区二区| 热re99久久精品国产66热6| 免费观看a级毛片全部| 午夜视频精品福利| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线av久久热| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品欧美亚洲77777| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 飞空精品影院首页| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线观看一区二区三区激情| 色尼玛亚洲综合影院| 久久精品国产清高在天天线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 午夜福利免费观看在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av福利片在线| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲综合色网址| 在线永久观看黄色视频| 我的亚洲天堂| 91成年电影在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| a级毛片在线看网站| 动漫黄色视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 欧美在线黄色| 久久热在线av| 国产免费现黄频在线看| 热99国产精品久久久久久7| a级毛片在线看网站| 动漫黄色视频在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 天天影视国产精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 十八禁网站免费在线| 午夜日韩欧美国产| 交换朋友夫妻互换小说| 国产亚洲一区二区精品| 国产国语露脸激情在线看| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品欧美亚洲77777| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品国产综合久久久| 在线看a的网站| 在线观看免费视频日本深夜| av福利片在线| 在线观看一区二区三区激情| 嫩草影视91久久| 在线观看免费午夜福利视频| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品欧美亚洲77777| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品国产国语对白av| 男女下面插进去视频免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 啦啦啦免费观看视频1| 中文字幕最新亚洲高清| 视频区欧美日本亚洲| 不卡av一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 91字幕亚洲| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一进一出好大好爽视频| 在线观看免费高清a一片| 男女之事视频高清在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 天天影视国产精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 麻豆国产av国片精品| 亚洲伊人色综图| 国产激情久久老熟女| www.999成人在线观看| 色播在线永久视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 婷婷成人精品国产| 成人国语在线视频| 亚洲,欧美精品.| 成人精品一区二区免费| 交换朋友夫妻互换小说| 一级黄色大片毛片| 在线观看午夜福利视频| 国产精品1区2区在线观看. | 久久草成人影院| av线在线观看网站| av福利片在线| 国产成人欧美| 中文欧美无线码| 激情视频va一区二区三区| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产激情欧美一区二区| 亚洲av成人av| 久久青草综合色| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜免费鲁丝| 国产一区二区三区综合在线观看| 怎么达到女性高潮| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产99久久九九免费精品| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 国产欧美亚洲国产| 精品久久久精品久久久| 高清毛片免费观看视频网站 | 在线永久观看黄色视频| 亚洲成人手机| 在线观看午夜福利视频| 精品人妻1区二区| 免费观看人在逋| 老司机亚洲免费影院| 91国产中文字幕| 极品少妇高潮喷水抽搐| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲性夜色夜夜综合| 麻豆成人av在线观看| 精品无人区乱码1区二区| av视频免费观看在线观看| 男男h啪啪无遮挡| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久香蕉国产精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 在线观看日韩欧美| av在线播放免费不卡| 黄片播放在线免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | tube8黄色片| 国产精品一区二区免费欧美| 男女之事视频高清在线观看| 国产成人欧美| 亚洲精品国产一区二区精华液| 天堂√8在线中文| a级毛片黄视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久国产亚洲av麻豆专区| a级毛片在线看网站| 久久精品国产a三级三级三级| 成人18禁在线播放| 国产av精品麻豆| 亚洲精品在线美女| 老司机福利观看| 岛国毛片在线播放| 一级a爱视频在线免费观看| 精品国产一区二区久久| 午夜免费观看网址| 精品久久久精品久久久| 久久午夜亚洲精品久久| av在线播放免费不卡| 成人精品一区二区免费| 国产成人影院久久av| 午夜影院日韩av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美在线一区亚洲| 99久久人妻综合| 久久热在线av| 在线看a的网站| 亚洲 国产 在线| 在线播放国产精品三级| 欧美激情高清一区二区三区| 悠悠久久av| 国产精品 欧美亚洲| 大陆偷拍与自拍| 久久久久久免费高清国产稀缺| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产视频一区二区在线看| 首页视频小说图片口味搜索| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 99国产精品免费福利视频| 激情在线观看视频在线高清 | 两个人免费观看高清视频| 咕卡用的链子| 麻豆国产av国片精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av电影中文网址| 一级作爱视频免费观看| 精品国产美女av久久久久小说| 一本大道久久a久久精品| 在线观看日韩欧美| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美日韩视频精品一区| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久亚洲精品不卡| 国产亚洲精品一区二区www | 国产xxxxx性猛交| 在线国产一区二区在线| 香蕉国产在线看| 精品久久久久久,| 91大片在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 午夜亚洲福利在线播放| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美精品一区二区免费开放| 国产日韩欧美亚洲二区|