響應(yīng)面法優(yōu)化微波萃取血紅鉚釘菇多糖及抗氧化活性研究

吳 也,劉中正,宋見(jiàn)喜,姜貴全

(北華大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 吉林 132013)

血紅鉚釘菇(Chroogomphidius viscidus)是鉚釘菇科，紅鉚釘菇屬，學(xué)名為紅蘑，俗稱松樹釘、松樹傘等.血紅鉚釘菇，初期鐘形或近圓錐形，后平展，中部凸起，淺咖啡色，菌肉帶紅色，干后淡紫紅色，近菌柄基部帶黃色[1].血紅鉚釘菇的生長(zhǎng)條件比較苛刻，生長(zhǎng)在海拔 500～700 m米的陰坡中，到了夏秋季節(jié)，可在松林地上往往可見(jiàn)到單生或者群生的血紅鉚釘菇[2].在我國(guó)，血紅鉚釘菇主要生長(zhǎng)于東北及河北北部地區(qū)，是東北一種珍貴的野生食用菌.其不僅口感豐富、香氣迷人，也被稱為“食用菌之王”，珍貴程度不亞于松茸和蟲草，在西方更把它視為珍品[3].血紅鉚釘菇不僅味道鮮美，而且有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4].研究發(fā)現(xiàn)，血紅鉚釘菇具有良好抗病毒和抗氧化能力，并且也有一定的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，其中最具有研究潛力的一類化學(xué)成分是多糖[5].多糖類化合物廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中，主要由醛基和酮基通過(guò)苷鍵連接的高分子聚合物，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一[6].

目前，關(guān)于血紅鉚釘菇多糖的提取方法主要有水提醇沉法、酶提取法、超聲波提取、微波萃取等[7].微波萃取技術(shù)可有效地保護(hù)血紅鉚釘菇多糖中的有效成分，具有高速、高產(chǎn)率、高選擇、低能耗、少溶劑等特點(diǎn)[8].響應(yīng)面法是一個(gè)集試驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型建立、因素影響評(píng)估、確定最佳工藝條件為一體的統(tǒng)計(jì)技術(shù)[9]，然而，它作為一種工具來(lái)研究和優(yōu)化微波萃取血紅鉚釘菇的提取條件還鮮有報(bào)道.

本文以微波萃取過(guò)程中影響多糖得率的幾個(gè)因素進(jìn)行研究，運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化血紅鉚釘菇的微波萃取條件.通過(guò) Box-Beknhen 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，從而得出血紅鉚釘菇多糖微波萃取的最佳工藝條件，得到的多糖經(jīng)除蛋白后，研究其抗氧化活性，為血紅鉚釘菇多糖的開發(fā)及綜合利用提供一定理論依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 試藥與試劑

血紅鉚釘菇產(chǎn)自吉林通化.

95%乙醇(分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酚(分析純)天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；葡萄糖(分析純)上海源葉生物科技有限公司；石油醚(分析純)天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；濃硫酸(分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠；DPPH試劑(分析純)上海展華化學(xué)有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N電子天平,上海菁海儀器設(shè)備制作有限公司； GZX-9146電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HH-8電熱恒溫水浴鍋,江蘇億通電子有限公司；CARY-5000紫外分光光度計(jì),美國(guó)瓦里安公司；MARS6微波萃取儀,美國(guó)CEM公司；DZF-6090電熱真空干燥箱,上海一恒科技有限公司；M32648九十六孔板,北京格瑞有限公司；DNM-9602A酶標(biāo)儀,北京普朗有限公司.

2 方 法

2.1 血紅鉚釘菇多糖的提取

參考侯秀娟等[10]方法：血紅鉚釘菇→烘干→粉碎過(guò)篩(40 目)→石油醚脫脂→加水?dāng)噭颉⒉ㄝ腿　^(guò)濾→濃縮→Sevage法去蛋白[11-12]→醇沉→冷凍干燥→血紅鉚釘菇多糖.

2.2 血紅鉚釘菇多糖含量的測(cè)定

參考張媛媛等[13-14]苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定樣品多糖含量.

2.2.1 苯酚溶液的配制

精確稱取苯酚晶體5 g加入至100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，配置成5%的苯酚溶液，充分搖勻后轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中備用.

2.2.2 葡萄糖對(duì)照樣品溶液配制

精確稱量葡萄糖對(duì)照樣品101.00 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，充分震蕩.再?gòu)娜萘科恐幸迫?0 mL置于100 mL容量瓶中，定容，搖勻備用.

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取葡萄糖對(duì)照樣品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.22 mL分別置于252mL比色皿中分別加水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL至2 mL，然后分別加入苯酚溶液1.6 mL搖勻震蕩，迅速加入濃硫酸7.0 mL，搖勻.顯色40 min；另以蒸餾水代替葡萄糖對(duì)照樣品溶液，同上操作，作為空白.

用紫外分光光度計(jì)在4 902 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度.求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.017 218x-0.022 239，R2=0.999 25，線性范圍為0.01～0.05 mg/mL.

葡萄糖質(zhì)量濃度(mg·mL-1)圖1 苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4 血紅鉚釘菇多糖含量的測(cè)定

多糖含量測(cè)定采用苯酚硫酸法[13-14]，血紅鉚釘菇多糖的產(chǎn)率按照以下公式得到

C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定得出的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL;V為血紅鉚釘菇多糖提取液的體積，mL;N為稀釋因數(shù);W為血紅鉚釘菇粉末的質(zhì)量，g.

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 液料比對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

2.3.2 微波功率對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

2.3.3 微波溫度對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

2.3.4 微波時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取微波時(shí)間(A)、微波溫度(B)、液料比(C)和微波功率(D)為因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn).根據(jù)Design-Expert(8.0.6)軟件中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多糖產(chǎn)率Y(%)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到最優(yōu)的血紅鉚釘菇多糖提取條件.共有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中有24個(gè)分析因子和5個(gè)零點(diǎn).零點(diǎn)試驗(yàn)共5次，用于預(yù)估誤差.分別用-1、0、1對(duì)各自變量的低、中、高3個(gè)試驗(yàn)水平進(jìn)行編碼[18-20].其因素水平表如下：

表1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)因素水平表

2.5 血紅鉚釘菇多糖中的蛋白去除

具體操作步驟為：將Sevage試劑加入到4倍體積的血紅鉚釘菇多糖溶液中，利用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢? h之后，置于分液漏斗中靜置分層，保留上層溶液，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定蛋白的去除率[21-23].

2.6 血紅鉚釘菇多糖清除DPPH自由基能力的測(cè)定I

2.6.1 溶液配制

(1)取血紅鉚釘菇多糖樣本稀釋至80 mg/mL，然后倍數(shù)稀釋至0.625 mg/mL，共8個(gè)濃度梯度，從低到高依次標(biāo)記為1至8號(hào).

(2)稱取7.88 mg DPPH，用無(wú)水乙醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻待用.

2.6.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別稱取100 μL樣品加入到96孔板中，再加入DPPH溶液100 μL，樣品組和對(duì)照組分別做3個(gè)平行樣，充分搖勻后，用錫紙包好進(jìn)行避光處理，置于25 ℃恒溫箱中靜置30 min.于517 nm處測(cè)得吸光度值.DPPH清除率計(jì)算公式為：

DPPH清除率(%)={1-(Ax-Ay)/A0}×100%

Ax為不同濃度樣品+DPPH吸光度值;Ay為不同濃度樣品+蒸餾水吸光度值;A0為蒸餾水+DPPH吸光度值[24-26].

3 結(jié)果與討論

3.1 血紅鉚釘菇多糖的提取

3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)液料比對(duì)多糖得率的影響

液料比(mL·g-1)圖2 液料比對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

(2)微波功率對(duì)多糖得率的影響

由圖3可知，在400 W至700 W范圍內(nèi)，多糖得率隨功率增強(qiáng)而提高，但在超過(guò)700 W后，多糖產(chǎn)率開始下降.分析原因可能是由于大功率微波使物料溫度升高，壓力增大，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，部分血紅鉚釘菇多糖發(fā)生水解且變性[28]，同時(shí)產(chǎn)生大量雜質(zhì)，對(duì)水的滲入造成較大阻礙，導(dǎo)致血紅鉚釘菇多糖的得率下降.

微波功率/W圖3 微波功率對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

(3) 微波溫度對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

由圖4可知，在70 ℃至100 ℃范圍內(nèi)，多糖得率隨著溫度的升高而增加.100 ℃之后，隨溫度升高，多糖得率開始下降，可能是由于溫度繼續(xù)升高使得多糖在高溫下分解，從而導(dǎo)致多糖得率開始下降[29].

微波溫度/℃圖4 微波溫度對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

(4) 微波時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)率的影響

由圖5可知，在5 min至10 min范圍內(nèi)，多糖得率隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，且在10 min時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)率，這是由于多糖溶出的過(guò)程是從固體溶質(zhì)向液體溶劑轉(zhuǎn)移的過(guò)程，在兩者尚未達(dá)到平衡時(shí)，隨時(shí)間增長(zhǎng)其作用時(shí)間越長(zhǎng)，最終達(dá)到平衡后，多糖得率達(dá)到最大；之后隨時(shí)間增長(zhǎng)多糖得率呈下降趨勢(shì).可能是由于微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使得細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)溶出增加或者部分多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，使得多糖得率降低[30].

微波時(shí)間/min圖5 微波時(shí)間對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率的影響

3.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

(1) 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以血紅鉚釘菇多糖得率為目標(biāo)值，選定4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果表

對(duì)上表試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于A、B、C、D的擬合方程如下：

多糖產(chǎn)率=14.77+0.097A-0.22B+0.28C+0.20D-0.12AB-0.26AC+0.15AD+0.13BC+0.44BD+0.29CD-0.44 A2-0.43B2-0.49C2-0.61D2

對(duì)此回歸模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 回歸模型方差分析表

由表3可以得出，多糖得率模型F值為33.66，P值小于0.000 1，此模型達(dá)到高度顯著水平，失擬項(xiàng)為0.785 7，失擬不顯著，表明實(shí)驗(yàn)與模型擬合程度比較好，實(shí)驗(yàn)誤差比較小，該方程能夠預(yù)測(cè)和解釋血紅鉚釘菇多糖得率隨微波萃取各因素變化的規(guī)律.

(2) 響應(yīng)面57圖形分析

根據(jù)回歸方程分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)等高線圖(見(jiàn)圖6)和曲面圖(見(jiàn)圖7)，以確定微波溫度、微波時(shí)間、微波功率和液料比這4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響，以此來(lái)推測(cè)出因變量.

圖6 各交互因素對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率影響的等高線圖

圖7 各交互作用對(duì)血紅鉚釘菇多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖

響應(yīng)面分析的圖形是特定的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量構(gòu)成的三維立體圖形，可以直觀反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可找到它們?cè)诜磻?yīng)過(guò)程中的交互作用[31].

圖7反映出了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值，即多糖得率的影響.等高線的形狀反映了交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，等高線若趨于圓形則表明兩個(gè)因素交互作用不顯著，趨于橢圓則相反[31].總體來(lái)看，除去功率和時(shí)間與功率和溫度兩組外，其他各組因素對(duì)多糖得率的影響都十分顯著.

3.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證其是否與真實(shí)情況一致或者相似.考慮到實(shí)際操作，將微波功率修正為600 W，按此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)三次，以驗(yàn)證試驗(yàn)檢測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值的相符程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均產(chǎn)率為15.31%，通過(guò)方差分析表明，實(shí)際測(cè)試值與預(yù)測(cè)值差異不顯著，說(shuō)明該模型可以較為可靠地模擬和預(yù)測(cè)血紅鉚釘菇多糖的產(chǎn)率，從而也證明了采用響應(yīng)面法優(yōu)化血紅鉚釘菇多糖提取條件參數(shù)的可行性.

3.2 Sevage法去蛋白試驗(yàn)結(jié)果

用Sevage法去除蛋白8次后，每次測(cè)定其吸光度，其結(jié)果見(jiàn)圖8.

去蛋白次數(shù)/次圖8 Sevage法去蛋白折線圖

由上圖可以看出，去蛋白到第7次后，吸光度與第6次相比極為接近，為減小損耗、節(jié)約試劑，本試驗(yàn)以去除6次為最佳.其余蛋白質(zhì)可能是通過(guò)化學(xué)鍵與多糖相連接，Sevage試劑無(wú)法將其除去.

3.3 血紅鉚釘菇多糖清除DPPH自由基能力的測(cè)定

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的多糖具備將自由基清除或者提高抗氧化活性來(lái)延緩氧化[32].DPPH自由基是一種十分穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在517 nm波長(zhǎng)處其孤對(duì)電子有較強(qiáng)的吸收，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱[33].本試驗(yàn)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，通過(guò)DPPH清除率計(jì)算公式來(lái)評(píng)價(jià)血紅鉚釘菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力.如圖9所示，血紅鉚釘菇多糖有顯著的清除DPPH自由基的能力，且在一定范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強(qiáng).6號(hào)樣品的DPPH自由基清除率最高，即濃度為20 mg/mL時(shí)，其自由基清除率為77%.

樣品序列圖9 血紅鉚釘菇多糖對(duì)DPPH自由基清除率折線圖

4 結(jié) 論

對(duì)所提取血紅鉚釘菇多糖的抗氧化實(shí)驗(yàn)顯示，血紅鉚釘菇多糖對(duì)DPPH自由基存在一定的清除能力，并且其清除能力與質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)存在一定的量效關(guān)系，表明血紅鉚釘菇多糖具有較好的抗氧化能力.