固相萃取分離-電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測(cè)定海產(chǎn)品中的無(wú)機(jī)砷

李林川 吳建偉 胡建西 畢晨曦 蘇 眾

(云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，昆明 650106)

前言

砷是一種常見(jiàn)的有毒元素，過(guò)量攝入會(huì)引起砷中毒，長(zhǎng)期低量接觸也會(huì)引起慢性砷中毒，誘發(fā)各種疾病。隨著毒理學(xué)的研究不斷深入，結(jié)果表明砷的毒性與其存在的形態(tài)密切相關(guān)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了30余種不同形態(tài)的砷化合物[1]，海產(chǎn)品中砷形態(tài)多樣，主要以無(wú)機(jī)砷As(Ⅴ)和As(Ⅲ)、二甲基砷酸鹽(DMA)、甲基砷酸鹽(MMA)、砷膽堿(AsC)和砷甜菜堿(AsB)形式存在[2]。有機(jī)砷通常被認(rèn)為是低毒或是無(wú)毒的，無(wú)機(jī)砷的毒性遠(yuǎn)高于有機(jī)砷，其中As(Ⅲ)毒性最強(qiáng)高達(dá)As(Ⅴ)的60倍以上[3]。因此，對(duì)于總砷含量較高的海產(chǎn)品其無(wú)機(jī)砷形態(tài)的分析比砷總量的測(cè)定更有意義，以砷的形態(tài)對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)更為科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。

目前砷的形態(tài)主要以HPLC-ICP-MS或HPLC-AFS作為其分析手段，利用色譜分離技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)砷的多種形態(tài)，兩者都具有選擇性好靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[4-10]，但其設(shè)備昂貴，聯(lián)用液相色譜設(shè)備不易維護(hù)，在實(shí)際樣品檢測(cè)中需要配置流動(dòng)相、還原劑、平衡色譜柱等一系列操作。在食品檢測(cè)時(shí)GB/T 2762—2017中規(guī)定“對(duì)于制定無(wú)機(jī)砷限量的食品可先測(cè)定其總砷，當(dāng)總砷水平不超過(guò)無(wú)機(jī)砷限量值時(shí)，不必測(cè)定無(wú)機(jī)砷；否則，需再測(cè)定無(wú)機(jī)砷”[6]，對(duì)于海產(chǎn)品其總砷水平一般較高，往往需要先測(cè)定完總砷水平后還需要再次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行無(wú)機(jī)砷的測(cè)定，同一樣品需要兩種獨(dú)立的檢測(cè)方法才能完成實(shí)驗(yàn)。HPLC與ICP-MS或AFS聯(lián)用測(cè)定無(wú)機(jī)砷的方法，耗時(shí)較長(zhǎng)實(shí)際樣品檢測(cè)效率不高。

介孔二氧化硅作為一種常見(jiàn)的吸附材料，對(duì)其進(jìn)行表面修飾或改性引入官能團(tuán)后可選擇性吸附不同的物質(zhì)，已應(yīng)用于環(huán)境、檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[11-12]。固相萃取(SPE)作為一種常見(jiàn)的前處理技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留、色素等檢測(cè)。氨基功能化的硅膠整體柱與ICP-MS聯(lián)用用于環(huán)境水樣中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定也見(jiàn)報(bào)道[12]。相比于環(huán)境水樣，海產(chǎn)品作為一種常見(jiàn)砷總量較高的食品，其基體較為復(fù)雜。本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，分別以N-(β氨乙基)--氨丙基三甲氧基硅烷(AEAPTMS)、3-巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)與四乙氧基硅烷(TEOS)水解共聚制備氨基功能化和巰基功能化的固相萃取小柱，擬將色譜分離過(guò)程手動(dòng)化用于As(Ⅴ)和As(Ⅲ)的富集與分離，結(jié)合ICP-MS測(cè)定砷含量。在檢測(cè)總砷時(shí)可同時(shí)進(jìn)行無(wú)機(jī)砷的測(cè)定，為食品砷形態(tài)分析及安全評(píng)價(jià)提供一種快速、高效的手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用主要試劑與儀器見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，來(lái)自Mili-Q(18.2 MΩ·cm)，其他試劑為優(yōu)級(jí)純。砷形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)溶液于冰箱-18 ℃保存，其他低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用去離子水稀釋得到。

表1 主要試劑與儀器

1.2 氨基功能化固相萃取小柱的制備

稱取0.176 g CTAB于20 mL離心管中加入1.8 mL無(wú)水乙醇，0.6 mL去離子水渦旋溶解完全，移取1.2 mL TEOS加入離心管中渦旋30 s，再移取0.4 mL AEAPTMS加入離心管中渦旋混合得到均一透明溶液，在室溫下(20～30 ℃)反應(yīng)20 h。反應(yīng)完畢用乙醇-水(1∶1V/V)渦旋離心洗滌5次，除去未反應(yīng)試劑后于50 ℃烘箱中烘干研細(xì)得到氨基鍵合硅膠材料。二氧化硅研細(xì)過(guò)篩選取74～96 μm粒徑物，用硝酸(20%)溶液浸泡20 h后用去離子水洗滌至中性，烘干備用。

稱取一份質(zhì)量的氨基鍵合硅膠材料與兩份質(zhì)量的二氧化硅均勻混合，填充于6 mL固相萃取小柱(或5 mL醫(yī)用注射器)中，填料厚度1 cm以填實(shí)緊壓為準(zhǔn)，備用。使用前依次用甲醇、水活化。

1.3 巰基功能化固相萃取小柱的制備

稱取0.176 g CTAB于20 mL離心管中，加入0.5 mL乙醇、1.0 mL甲醇、1.0 mL乙酸溶液(0.2 mol/L)，渦旋至CTAB溶解。移取1.2 mL TEOS、0.4 mL MPTMS加入離心管中，渦旋得到均一透明的溶液在50 ℃烘箱中水解2 h(期間如分層需渦旋振蕩混勻)。

水解完畢，取出離心管冷卻至室溫，滴加氨水溶液(10%，V/V)至堿性，繼續(xù)于50 ℃烘箱中反應(yīng)1 h使TEOS和MPTMS水解產(chǎn)物快速聚合，反應(yīng)完畢依次用甲醇、去離子水渦旋離心洗滌5次，于50 ℃烘箱中烘干研細(xì)得到巰基鍵合硅膠材料。

稱取一份質(zhì)量的巰基鍵合硅膠材料與兩份質(zhì)量的二氧化硅均勻混合，填充于5 mL固相萃取小柱(或5 mL醫(yī)用注射器)中，填料厚度1 cm以填實(shí)緊壓為準(zhǔn)，備用。使用前依次用甲醇、水活化。

1.4 樣品檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取1.00 g經(jīng)粉碎的樣品，加入20 mL硝酸溶液(0.15 mol/L)搖勻放置過(guò)夜。于90 ℃恒溫箱中浸提2.5 h，每0.5 h搖勻1 min，提取完畢，冷卻至室溫。8 000 r/min離心15 min。取上層清液置于離心管中加入5 mL正己烷，震搖1 min后8 000 r/min離心15 min，棄去上層正己烷，按此步驟重復(fù)一次[7]。將氨基功能化SPE小柱與巰基功能化SPE小柱按圖1所示連接。移取10 mL試液調(diào)節(jié)pH值注入SPE小柱中，調(diào)整真空泵壓力使試液以0.5 mL/min的流速通過(guò)兩段SPE小柱。吸附完畢SPE小柱經(jīng)少量去離子水洗滌后，分別用3 mL硝酸(1.5%)溶液以0.5 mL/min的流速洗脫氨基化小柱3次，用3 mL KIO3(0.1 mol/L)+硝酸(1.5%)溶液以0.5 mL/min的流速洗脫巰基化小柱3次，流出液分別用10 mL容量瓶接取，定容以ICP-MS分別檢測(cè)As(Ⅴ)與As(Ⅲ)含量。

圖1 吸附裝置連接示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基功能化固相萃取小柱的性能

四乙氧基硅烷作為共縮聚前體，水解后產(chǎn)生乙氧基、硅羥基，N-(β氨乙基)--氨丙基三甲氧基硅烷，由于自身兩個(gè)氨基化官能團(tuán)的存在無(wú)需其他堿性溶劑的存在也能自發(fā)水解產(chǎn)生硅羥基、甲氧基。在反應(yīng)溶液中乙氧基、硅羥基、甲氧基之間相互縮合，形成硅烷鏈，兩個(gè)功能化氨基也由甲氧基而鍵合到了硅烷鏈中，從而使硅膠材料具備了氨基的功能。

2.1.1 選擇性

在pH<4的溶液中As(Ⅴ)以負(fù)離子的形式存在而被吸附到氨基化材料中，而MMA、DMA、As(Ⅲ)在此條件下以中性條件存在不能被萃取。實(shí)驗(yàn)中考察了氨基鍵合硅膠材料在不同pH值條件下對(duì)100 ng/mL四種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸附率(如圖2所示)。在pH=2～9，材料對(duì)As(Ⅴ)的吸附率均在90%以上，對(duì)As(Ⅲ)吸附率均在7%以下。pH<4的條件下，MMA、DMA在溶液中難電離而不容易被材料吸附，隨著pH值增大，MMA、DMA逐漸變?yōu)殛庪x子形式存在，材料對(duì)其吸附率逐漸增大。

圖2 不同pH值下氨基材料對(duì)砷的吸附率趨勢(shì)圖

2.1.2 洗脫液的選擇

溶液pH值對(duì)砷的形態(tài)及吸附機(jī)理均有一定影響，在pH=3～8時(shí)，As(Ⅴ)能以靜電吸附力被吸附到硅烷鏈末端的氨基官能團(tuán)上。隨著pH值的減小，As(Ⅴ)在溶液中難以電離，吸附率逐漸變小。實(shí)驗(yàn)以不同pH值，濃度為50 ng/mL的As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行吸附(結(jié)果見(jiàn)表2)。表2結(jié)果可見(jiàn)當(dāng)pH<3時(shí)，SPE小柱對(duì)As(Ⅴ)吸附開(kāi)始減小，pH<1時(shí)，吸附率小于20%。因此考慮可用pH值較小的稀酸溶液進(jìn)行洗脫，后續(xù)ICP-MS法測(cè)定時(shí)硝酸濃度一般為2%，因此選用硝酸(2%)作為洗脫液洗脫As(Ⅴ)。

表2 不同pH值對(duì)As(Ⅴ)吸附率影響

2.2 巰基功能化固相萃取小柱的性能

氨基官能團(tuán)對(duì)五價(jià)砷有良好的吸附性能，而巰基官能團(tuán)則對(duì)三價(jià)砷有較好的螯合作用。與氨基鍵合硅膠材料類似，MPTMS通過(guò)水解得到了硅羥基與甲氧基，在堿催化條件下與TEOS水解產(chǎn)物發(fā)生縮聚反應(yīng)，成功將巰基官能團(tuán)鍵合到了硅烷鏈中。材料中存在的巰基官能團(tuán)對(duì)As(Ⅲ)的螯合作用，其他官能團(tuán)存在較弱的靜電吸附力，隨著pH值增大，As(Ⅴ)、MMA、DMA逐漸電離從而能被材料吸附。

2.2.1 選擇性

對(duì)不同pH值的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行吸附試驗(yàn)(結(jié)果見(jiàn)圖3)，pH=2～9，巰基鍵合的硅膠材料對(duì)As(Ⅲ)都有較好的選擇性，吸附率達(dá)到了90%以上，隨著pH值增大，材料對(duì)As(Ⅴ)、MMA、DMA吸附率逐漸增大。在pH<4的條件下，材料對(duì)其他3種形態(tài)的砷均無(wú)吸附作用，吸附率均在6%以下。

圖3 不同pH值下巰基材料對(duì)砷的吸附率趨勢(shì)圖

2.2.2 洗脫液的選擇

巰基官能團(tuán)對(duì)As(Ⅲ)的吸附機(jī)理為螯合作用，無(wú)法像As(Ⅴ)一樣通過(guò)減小洗脫液pH值對(duì)As(Ⅲ)進(jìn)行洗脫。采用2%、3%、5%硝酸溶液(V/V)均無(wú)法將As(Ⅲ)從巰基SPE小柱上洗脫。利用洗脫液中巰基與巰基鍵合材料中巰基相互爭(zhēng)奪As(Ⅲ)的原理，采用巰基乙醇(10%)+硝酸溶液(3%)洗脫，回收率也只達(dá)到60%。最終，用含KIO3(0.1 mol/L)稀硝酸溶液洗脫，利用碘酸鉀將硅烷鏈末端-SH氧化，使材料失去吸附作用的原理，洗脫回收率達(dá)到了96%(結(jié)果見(jiàn)表3)。因此，結(jié)合ICP-MS法檢測(cè)，最終選取As(Ⅲ)洗脫液為KIO3(0.1 mol/L)+硝酸(2%)。

表3 不同洗脫液As(Ⅲ)的回收率

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

2.3.1 pH值及樣品流速

樣品經(jīng)0.15 mol/L稀硝酸提取砷后，溶液pH值較低，氨基功能化SPE小柱在pH<3的條件下吸附率有所下降。氨基功能化SPE小柱和巰基功能化SPE小柱在pH<4的條件下能選擇性吸附As(Ⅴ)與As(Ⅲ)，排除了有機(jī)砷干擾。因此選擇在移取10 mL試樣溶液后，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)移取的溶液pH值至3～4再進(jìn)行吸附。

樣品的流速也會(huì)影響不同形態(tài)砷在材料上的保留行為，流速過(guò)高溶液保留時(shí)間過(guò)短，萃取不完全；流速過(guò)低則使檢測(cè)速度變慢效率較低。實(shí)驗(yàn)中所制備的氨基、巰基鍵合硅膠材料粒徑較小填充后溶液通過(guò)性較差，因此制備了粒徑稍大的SiO2粉末混合于硅膠材料填充，在不影響吸附率的前提下提高了溶液的通過(guò)性。實(shí)驗(yàn)考察了不同流速下，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的回收率(結(jié)果見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明溶液流速在0.1～1 mL/min時(shí)，回收率可達(dá)到90%以上，隨著流速繼續(xù)增大，回收率變低。考慮到實(shí)際樣品基質(zhì)的影響，為了使樣品溶液中砷能夠被充分萃取，選擇了0.5 mL/min作為樣品溶液的流速及洗脫流速。

2.3.2 樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)比與加標(biāo)回收率

為驗(yàn)證方法的實(shí)用性與準(zhǔn)確性，利用所建立的固相萃取小柱分離富集三種不同基質(zhì)的樣品：紫菜、扇貝粉、小魚干中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，SPE-ICP-MS測(cè)定三種基質(zhì)樣品無(wú)機(jī)砷含量均低于100 μg/kg，6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)相對(duì)平均偏差在4.1%～30.6%(結(jié)果見(jiàn)表4)，除較低含量樣品外該方法精密度(RSD)均在20%以下滿足日常檢測(cè)需求。

圖4 不同流速下As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的回收率

ICP-MS法檢測(cè)結(jié)果與HPLC-AFS法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較(見(jiàn)表5)，結(jié)果表明三種基質(zhì)樣品用不同方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%。實(shí)驗(yàn)采用加標(biāo)回收的方式考察所檢測(cè)樣品結(jié)果的準(zhǔn)確性(見(jiàn)表6)，加標(biāo)回收率在72.3%～102%，表明方法用于海產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

表4 SPE-ICP-MS法精密度結(jié)果

表5 不同方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

表6 實(shí)際樣品檢測(cè)加標(biāo)回收結(jié)果

3 結(jié)論

利用各類硅烷試劑水解、縮聚的原理，將氨基官能團(tuán)與巰基官能團(tuán)鍵合到了硅烷鏈中，成功制備了能夠選擇性吸附無(wú)機(jī)砷的硅膠材料。分段式氨基化小柱與巰基化小柱聯(lián)用能夠排除有機(jī)砷以及As(V)與As(Ⅲ)之間的相互干擾，所建立的固相萃取小柱-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定無(wú)機(jī)砷的方法通過(guò)手動(dòng)分離可以實(shí)現(xiàn)樣品總砷與無(wú)機(jī)砷快速同時(shí)檢測(cè)，方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%，樣品加標(biāo)回收率在72.3%～102%。該方法用于海產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷形態(tài)的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，提高效率的同時(shí)降低了檢測(cè)成本，可作為食品檢測(cè)與安全評(píng)價(jià)的另一種檢測(cè)手段。