TLR4抑制劑TAK-242預處理改善急性缺血性腦卒中誘導的腸黏膜屏障損傷①

伉 奕 楊涌濤 馬 宇 程 惠 石燕芳 王 玥 展群嶺 萬 東

(重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院腦病科，重慶 400080)

腦卒中是一類由腦血管病變引發(fā)的神經(jīng)功能缺損的腦血管疾病，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類[1]。其中缺血性腦卒中的發(fā)病率、病死率和復發(fā)率遠高于出血性腦卒中[2]。急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)發(fā)生時機體會產(chǎn)生強刺激引起全身的應激反應，進而引發(fā)其他遠端臟器發(fā)生病理改變。腸道是應激反應的中心器官，也是重要的靶器官，腦卒中應激引起的消化道癥狀在臨床上很常見，如腹脹、便秘等[3]，但由此引發(fā)的腸黏膜屏障損傷機理未見確切報道。因此，研究AIS病程中腸黏膜屏障功能障礙的發(fā)生機制具有重要臨床意義。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)是固有免疫的重要組成部分，可構成腸道的第一道保護屏障，既是細胞內(nèi)的跨膜信號傳導分子，又是細胞表面的免疫識別受體。有研究表明，急性肝衰竭誘導的腸黏膜屏障損傷中，LPS/TLR4/MyD88信號通路被激活，TLR4表達水平顯著上調[4]；也有研究認為，LPS可以通過激活TLR4/MyD88信號通路而影響腸上皮緊密連接，會導致腸道通透性增加，腸黏膜屏障破壞[5]。然而，TLR4是否參與AIS誘導的腸黏膜屏障損傷，目前還未曾報道。本研究通過線栓法制備大鼠中動脈栓塞所致的大鼠AIS模型，觀察TLR4抑制劑TAK-242預處理對大鼠腸黏膜損傷的影響，以期為AIS的治療提供思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠45只，7～8周齡，體重(260±20)g，由湖北省動物實驗中心提供，動物合格證編號：SCXK(鄂)2019-0013。飼養(yǎng)條件：溫度為24℃，濕度為50%，通風良好，明暗光照交替12 h，標準飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水。

1.1.2主要儀器及試劑 TAK-242又名Resatorvid(瑞沙托維)，購自美國MedChemExpress公司；二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、IL-6、內(nèi)毒素(endotoxin，ET)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、D-乳酸(D-Lactate， D-Lac)和IL-1β檢測試劑盒購自美國R&D公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-Dextran)購自美國Sigma公司；Claudin-1、ZO-1、TLR4、MyD88、NF-κB p65和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1動物造模及分組處理 將45只SPF級雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分成3組，即假手術組(sham)、模型組(model)、TAK-242預處理組(TAK-242)，每組15只。所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，參照文獻[6]采用改良Longa線栓法制作AIS大鼠模型，術后待大鼠清醒后采用Zea-Longa五級評分法進行評估，以1～3分為造模成功。其中sham組大鼠僅暴露頸動脈不插入線栓。術前24 h，TAK-242組大鼠經(jīng)尾靜脈注射TAK-242(10 mg/kg)[7]，sham組和model組大鼠分別注射等量生理鹽水。

1.2.2神經(jīng)功能缺損評分 各組大鼠于造模24 h后，采用Zea-Longa五級評分法評估神經(jīng)功能缺損情況，0分：未觀察到神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：不能完全伸展左前肢，輕度神經(jīng)功能缺失；2分：向左側轉圈，中度神經(jīng)功能缺失；3分：向左側傾倒，重度神經(jīng)功能缺失；4分：無法正常行走，意識水平低下。評分越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴重[8]。

1.2.3TTC法評估大鼠腦梗死面積 造模24 h后，各組隨機取5只大鼠，采用斷頭法處死大鼠，取腦并剔除小腦和低位腦干，立即放入-20℃冷凍，取出后沿冠狀位從額極向后連續(xù)切片(約2 mm)，2%TTC 染液于37℃避光染色15 min。正常區(qū)域呈鮮紅色，梗死區(qū)域呈白色。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算腦梗死面積占腦組織總面積的百分比(%)。

1.2.4ELISA檢測大鼠血清相關指標 腹主動脈取血，以3 000 r/min離心5 min，分離血清，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，根據(jù)標準曲線計算血清中DAO、D-Lac、ET、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.2.5FITC-Dextran示蹤法[9]檢測大鼠腸黏膜通透性 各組隨機取5只大鼠，于造模后20 h，采用0.4 mg/g FITC-Dextran進行灌胃處理，4 h后采血，肝素鈉抗凝，3 500 r/min離心15 min。取25 μl血漿加入100 μl PBS，用全波長多功能酶標儀測定其熒光強度，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，制作標準曲線并計算樣品濃度。

1.2.6HE染色觀察大鼠腸黏膜組織病理學變化 取距Treitz韌帶5 cm處部分空腸組織，PBS液洗凈后用10%甲醛固定24 h，隨后進行脫水處理，并進行石蠟包埋，制作石蠟切片，厚度為3～4 μm，行HE染色，于顯微鏡下觀察病理改變，采用Chui′s評分評價腸損傷情況[10]。

1.2.7Western blot檢測大鼠小腸組織中相關蛋白表達 收集各組大鼠小腸組織，加入預冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，收集上清，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白煮沸變性后上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Claudin-1、ZO-1、TLR4、MyD88、NF-κB p65和β-actin一抗，4℃孵育過夜。次日加入相應二抗室溫孵育1 h，ECL試劑曝光顯影。以目的蛋白與β-actin灰度比值表示該目的蛋白的相對表達量。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Fig.1 Comparison of neurological scores of rats in each groupNote:Compared with sham group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

2 結果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 如圖1所示，與sham組比較，model組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)。

2.2TAK-242預處理對AIS大鼠腦梗死面積的影響 如圖2所示，sham組大鼠未出現(xiàn)腦梗死現(xiàn)象，而model組和TAK-242組大鼠均出現(xiàn)腦梗死現(xiàn)象。與model組比較，TAK-242組大鼠腦梗死面積顯著降低(P<0.05)。

2.3TAK-242預處理對AIS大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量的影響 如圖3所示，與sham組比較，model組大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量顯著降低(P<0.05)。

2.4TAK-242預處理對AIS大鼠血清中炎癥因子水平的影響 如圖4所示，與sham組比較，model組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6顯著降低(P<0.05)。

2.5TAK-242預處理對AIS大鼠腸黏膜通透性的影響 如圖5所示，與sham組比較，model組大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組大鼠腦梗死面積比較

圖3 各組大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量比較Fig.3 Comparison of DAO，D-Lac and ET contents in serum of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

2.6TAK-242預處理對AIS大鼠腸黏膜組織病理變化的影響 如圖6A所示，sham組大鼠小腸黏膜完好，腸上皮細胞未見破壞，絨毛排布規(guī)整，刷狀緣光整平滑；model組有嚴重的組織損傷，絨毛萎縮變形，腸隱窩加深，大量炎癥細胞浸潤，毛細血管充血；與model組比較，TAK-242組絨毛高度恢復，隱窩排列整齊，各層結構相對清晰完整。如圖6B所示，與sham組比較，model組Chui′s評分顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組Chui′s評分顯著降低(P<0.05)。

圖4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較Fig.4 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents in serum of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

圖5 各組大鼠腸黏膜通透性的比較Fig.5 Comparison of intestinal permeability of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

圖6 各組大鼠小腸組織切片病理觀察

2.7TAK-242預處理對AIS大鼠小腸組織緊密連接蛋白表達的影響 如圖7所示，與sham組比較，model組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著降低(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著升高(P<0.05)。

2.8TAK-242預處理對AIS大鼠小腸組織TLR4/NF-κB信號通路的影響 如圖8所示，與sham組比較，model組大鼠小腸組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著上升(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠小腸組織中MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，TLR4蛋白水平變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖7 各組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達比較Fig.7 Comparison of Claudin-1 and ZO-1 protein expression in small intestine of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01，***.P<0.001;compared with model group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖8 各組大鼠小腸組織中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達比較Fig.8 Comparison of TLR4，MyD88 and NF-κB p65 protein expression in small intestine of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

3 討論

胃腸道作為人體重要的組織系統(tǒng)，是營養(yǎng)物質消化、吸收、轉運的主要器官。正常情況下，腸道黏膜的各種生理性屏障可以保證致病因素無法越過屏障侵入腸道以外的地方，但遭受打擊或應激狀態(tài)下，屏障完整性被破壞，腸道就成了各種毒素和病原微生物入侵機體的第一道防線。目前認為腸道在應激時是多器官功能障礙的始動器官，AIS可使機體處于一種強烈的應激狀態(tài)。本實驗中使用的TLR4信號通路抑制劑TAK-242分子量小，可在機體組織中迅速分散，直接結合TLR4胞內(nèi)區(qū)域，從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生[11]。本研究結果顯示，TAK-242預處理可有效改善AIS大鼠神經(jīng)功能以及腸黏膜屏障損傷。

D-乳酸(D-Lac)是腸道內(nèi)多種細菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，如大腸桿菌、克雷伯桿菌、乳酸桿菌等。正常生理條件下，腸道內(nèi)的D-Lac在腸黏膜機械屏障的屏蔽下很少被吸收，但當腸黏膜屏障功能發(fā)生障礙時，D-Lac可經(jīng)由損傷的腸黏膜入血，導致D-Lac的生成量上升，因此血液中D-Lac的含量能夠作為評價腸黏膜受損傷程度的一個重要指標[12]。二胺氧化酶(DAO)是存在于哺乳動物小腸黏膜上皮細胞內(nèi)的一種酶，它能夠分解氨基酸代謝過程中產(chǎn)生的胺。在腸黏膜上皮細胞無損傷的情況下，血漿中無DAO的出現(xiàn)，但當腸黏膜上皮細胞被破壞時，細胞內(nèi)的DAO便會釋放入血，使血液中的含量上升，故DAO水平可以反映腸黏膜屏障功能及通透性的變化[13]。內(nèi)毒素(ET)是促使機體發(fā)生炎癥反應的重要因素之一，腸道黏膜屏障可導致腸道內(nèi)ET移位至血液循環(huán)系統(tǒng)，因而血液ET含量常被作為臨床判斷機體腸道黏膜屏障功能的指標[14]。有研究顯示，重癥急性胰腺炎(SAP)誘導的大鼠胃腸功能障礙模型中，血清D-Lac和ET水平顯著上調，右美托咪定可減輕SAP大鼠胃腸黏膜的損傷，下調D-Lac和ET的水平[15]。本研究結果顯示，AIS大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量顯著升高，表明腸黏膜屏障功能被破壞；而TAK-242預處理后可降低大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量，說明抑制TLR4的表達可以有效減輕屏障的損傷。

在眾多腸道屏障功能障礙的損傷機制中，炎癥介導損傷屬于其中極其重要的一部分[16]。正常情況下，炎癥反應本身屬于機體自身的保護機制，但在反應激烈不受控制的情況下會呈現(xiàn)出“瀑布樣”反應，對機體造成嚴重損傷。AIS誘導的腸黏膜屏障損傷將導致腸道內(nèi)細菌和內(nèi)毒素移至血液循環(huán)系統(tǒng)，從而誘發(fā)全身炎癥反應綜合征(SIRS)，甚至是多系統(tǒng)功能衰竭綜合征(MODS)。故本研究檢測了各組大鼠血清中炎癥因子水平，結果顯示AIS大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著上升；而TAK-242預處理后大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著降低。說明干預TLR4表達可以抑制AIS大鼠腸黏膜屏障損傷介導的炎癥反應。

FITC-Dextran是一種低分子多聚糖，正常情況下，機體不含F(xiàn)ITC-Dextran且不被小腸吸收，經(jīng)胃管進入消化道的FITC-Dextran進入血液循環(huán)的唯一方式便是破壞腸道屏障的完整性。血漿中的熒光強度越強，F(xiàn)ITC-Dextran的濃度越高，提示腸黏膜屏障損傷越嚴重[17]。本研究結果顯示，AIS大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著升高，與既往研究結果一致[9]；而采用TAK-242預處理后大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著降低。同時病理結果顯示，模型組大鼠的腸黏膜組織被破壞，腸絨毛減少且頂端上皮細胞壞死，腸黏膜內(nèi)可見大量炎癥細胞浸潤；而TAK-242預處理后大鼠腸黏膜厚度及絨毛長度恢復，隱窩排列整齊，各層結構相對清晰完整。說明腸黏膜屏障保護系統(tǒng)與TLR4的表達具有相關性，抑制其表達可降低腸上皮細胞的通透性，緩解腸黏膜的損傷。

TLR4作為腸道固有免疫的重要組成部分，構成了腸道對細菌識別的第一道屏障，它既是細胞表面免疫識別受體，又是胞內(nèi)跨膜信號傳導分子。在TLR4激活后的信號傳遞過程中，MyD88依賴的信號途徑占主導地位，通過依次活化多個胞內(nèi)信號銜接分子，最終激活通路下游的NF-κB從而調控多種炎癥介質的表達[18-19]。此外，腸黏膜結構系統(tǒng)中包含緊密連接蛋白，其中膜蛋白ZO-1和跨膜蛋白Claudin-1是兩種典型的緊密連接蛋白。他們的存在影響腸道選擇性屏障功能，無論是變異、減少還是缺失都會導致腸上皮細胞的通透性提高，從而使內(nèi)毒素等大分子物質進入體循環(huán)。故ZO-1和Claudin-1的表達水平能在一定程度上反映腸屏障損傷情況[20-21]。本研究結果顯示，AIS大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著降低，而TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著上升；采用TAK-242預處理后大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著升高，MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著降低，而TLR4蛋白水平改變無統(tǒng)計學意義，這主要與TAK-242的作用原理相關，TAK-242對TLR4信號通路的抑制作用主要是通過下調 TLR4下游信號分子MyD88蛋白的表達發(fā)揮抑制作用[22]。由此可以推測AIS誘導的腸黏膜屏障損傷與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關。

綜上所述，TLR4抑制劑TAK-242可通過抑制TLR4/NF-κL信號通路介導的炎癥反應，從而改善AIS誘導的腸道屏障功能損傷，本研究結果可為AIS誘導的腸黏膜屏障損傷的防治提供新的理論依據(jù)。此外，腸道炎癥反應是腸黏膜屏障損傷的早期表現(xiàn)，而本研究并未對腸道局部炎癥因子水平進行檢測，這是本文的不足之處，后續(xù)研究中將進行完善。