多次輸血尿毒癥患者免疫抗-Jk3引起輸血無(wú)效及家系分子生物學(xué)研究①

龔晨輝 饒美英 周 芬 余 玲 胡 芬 葉水文 (江西省南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006)

Kidd血型系統(tǒng)誘導(dǎo)的同種免疫抗體是除ABO、Rh系統(tǒng)外引起溶血性輸血反應(yīng)的主要同種抗體，其血型抗原是SLC14A1基因的產(chǎn)物，也是紅細(xì)胞膜上尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。正常紅細(xì)胞表達(dá)Jka或Jkb抗原，當(dāng)SLC14A1基因發(fā)生變異時(shí)，可以使Jka或Jkb抗原性消失，并導(dǎo)致紅細(xì)胞對(duì)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降。因此，在傳統(tǒng)血清學(xué)中，以2 mol/L尿素與樣本紅細(xì)胞反應(yīng)15 min 后不溶血作為Jknull表型的篩選方法。Jknull血型經(jīng)同種免疫后易產(chǎn)生高頻抗原抗體即抗-Jk3，該抗體與所有正常表達(dá)Jka或Jkb抗原的紅細(xì)胞發(fā)生凝集。近年，國(guó)內(nèi)外少有此抗體引起溶血性輸血反應(yīng)的報(bào)道，因此本課題組對(duì)患者及其家庭成員的Kidd血型進(jìn)行血型血清學(xué)檢測(cè)與分子生物學(xué)分析，研究Jknull表型的分子機(jī)理和遺傳背景，為此類(lèi)稀有血型患者輸血提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)，同時(shí)提示需要長(zhǎng)期輸血患者的檢測(cè)手段與建議，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 患者，女，51歲，尿毒癥病史2年。因發(fā)熱、頭暈3 d，伴昏迷半天入院治療，親屬敘述無(wú)輸血治療史。1 d：入院血常規(guī)檢查Hb:42 g/L，申請(qǐng)濾白懸浮紅細(xì)胞2U，膽紅素未見(jiàn)異常。輸血前檢測(cè): O型，Rh(D)陽(yáng)性，抗體篩查陰性；隨著患者多次輸注異體紅細(xì)胞后，直抗陽(yáng)性逐漸增強(qiáng)(凝集強(qiáng)度越大代表效價(jià)越高);交叉配血實(shí)驗(yàn)結(jié)果：主側(cè)陰性，次側(cè)陽(yáng)性。21 d: 因當(dāng)?shù)嘏溲щy，尋求上級(jí)醫(yī)院會(huì)診。其他輸血相關(guān)信息見(jiàn)表1。

1.1.2試劑和儀器 抗人球蛋白(抗IgG、抗C3d)檢測(cè)卡(微柱凝膠法)、抗人球蛋白(抗IgG+C3d)檢測(cè)卡(柱凝集法)、不規(guī)則抗體篩選紅細(xì)胞試劑均為江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；譜細(xì)胞、抗人球蛋白(抗IgG)、抗-Jka標(biāo)準(zhǔn)血清、抗-Jkb標(biāo)準(zhǔn)血清均為美國(guó)Immucor公司產(chǎn)品；酸放散試劑為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；尿素為西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品，所有試劑均按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。離心機(jī) (KA-2200)為日本久保田公司產(chǎn)品；全血DNA提取試劑盒、人類(lèi)紅細(xì)胞稀有血型基因分型試劑盒、SLC14A1基因測(cè)序試劑盒均為江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；自動(dòng)化核酸提取設(shè)備(Gene Pure Plus)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)系統(tǒng)(LineGene 9600 Plus)均為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1血清學(xué)檢測(cè) 按照《全國(guó)臨床檢測(cè)操作規(guī)程》對(duì)標(biāo)本進(jìn)行血型鑒定、不規(guī)則抗體鑒定等檢測(cè)[1]。直抗陽(yáng)性樣本按酸放散說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2分子生物學(xué)分析 運(yùn)用磁性微珠分離技術(shù)，采用全血DNA提取試劑盒在自動(dòng)化核酸提取設(shè)備完成基因組純化。JKA/JKB 基因分型使用人類(lèi)紅細(xì)胞稀有血型基因分型試劑盒，采用熒光溶解曲線法技術(shù)。Kidd基因擴(kuò)增與測(cè)序分析使用Kidd測(cè)序科研試劑盒進(jìn)行PCR序列特異性引物與測(cè)序引物進(jìn)行分析，測(cè)序結(jié)果使用Geneious序列判讀軟件，將結(jié)果與參比序列(Jk*01)進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果

2.1先證者輸血記錄與檢驗(yàn)結(jié)果 患者輸血前后血紅蛋白(Hb)、總膽紅素(TBI)、直接膽紅素(DBI)、間接膽紅素(IBI)檢測(cè)值變化見(jiàn)圖1。

2.2血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 21 d樣本進(jìn)行毛細(xì)管離心，近心端與遠(yuǎn)心端樣本的直接抗人球蛋白分型、2 mol/L 尿素溶解試驗(yàn)、標(biāo)清定型結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3不規(guī)則抗體篩選與鑒定 患者血漿樣本抗篩陽(yáng)性，抗體鑒定結(jié)果為高頻抗體、與所有譜細(xì)胞均為4+凝集，與患者經(jīng)毛細(xì)管離心后近心端樣本不凝集。酸放散液與所有譜細(xì)胞均2+凝集，與患者經(jīng)毛細(xì)管離心后近心端樣本不凝集。

2.4分子生物學(xué)分析 所有家系成員含先證者基因分型結(jié)果皆為Jk(a-b+)。先證者測(cè)序結(jié)果為：341+12CT，342-1GA，222CA，499AG，588GG，838AA;先證者丈夫測(cè)序結(jié)果為: 499GG，588GG，838AA;先證者子代測(cè)序結(jié)果為:341+12CT、342-1GA、499AG、588GG、 838AA，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行先證者等位基因分析，其一等位基因?yàn)?341+12C>T，342-1G>A，588 A>G，838G>A，另一等位基因?yàn)椋?22C>A，499 A>G，588A>G，838G>A。先證者子代攜帶先證者等位基因(341+12C>T，342-1G>A，588A>G，838G>A)，見(jiàn)圖3。

圖1 先證者入院后的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和輸血記錄Fig.1 Proband′s lab data and transfusion record since admit to hospitalNote:IAT.indirect coombs test， DAT.direct coombs test,Major.crossm-atch major compatible， Minor.crossmatch minor compatible， LPR.leukocyte poor RBC，WRBC.washed RBC，0.Negtive;1+.agglutinating cells are in the middle and lower part of gel card;2+.agglutination cells were found in the upper,middle and lower parts of gel cards;3+.agglutination in the upper and middle part of the gel card;4+.agglutination at the top of the gel card (the higher the agglutination intensity,the higher the titer);dcp.double cell population.

表1 毛細(xì)管離心后的直抗、2 mol/L尿素和Kidd表型結(jié)果

圖2 先證者的SLC14A1序列結(jié)果Fig.2 SLC14A1 sequence result in proband

圖3 先證者的遺傳家系圖譜Fig.3 Molecular pedigree analysis of proband

3 討論

有輸血史患者一旦產(chǎn)生高頻抗體，便不易與自身抗體區(qū)分，因?yàn)榻诨颊唧w內(nèi)輸入的獻(xiàn)血員紅細(xì)胞與患者免疫刺激生成的同種抗體發(fā)生凝集導(dǎo)致直抗陽(yáng)性。先證者在高頻抗體產(chǎn)生前Hb從42 g/L上升至輸血后52 g/L，顯示此時(shí)輸血有效，但后續(xù)輸血由于先證者近期密集輸血與直抗陽(yáng)性，將高頻抗體誤判為自身抗體[2-3]。先證者在住院第13天、20天、21天輸血后未見(jiàn)Hb明顯上升，且膽紅素在1 d 內(nèi)急劇升高，由此提示獻(xiàn)血員紅細(xì)胞在患者體內(nèi)大量破壞，考慮患者出現(xiàn)由同種抗體或合并自身抗體導(dǎo)致的遲發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)[4]。經(jīng)毛細(xì)管離心試驗(yàn)處理樣本后，患者新生成紅細(xì)胞不與患者血漿發(fā)生凝集且直抗陰性，由此進(jìn)行高頻抗體分析[5-6]。

中國(guó)人群的高頻抗體頻率占所有紅細(xì)胞免疫抗體頻率0.05%以下，以抗-Jk3、抗-Dib、抗-P1PPk相對(duì)常見(jiàn)。Kidd血型刺激產(chǎn)生的抗體在血漿中可能迅速下降至很低或不能被檢測(cè)的水平，給該類(lèi)抗體檢測(cè)帶來(lái)一定困難[7-10]。但在過(guò)去的案例報(bào)告中，抗-Jk3不乏嚴(yán)重和致命的急性溶血性輸血反應(yīng)，也有遲發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)的案例報(bào)導(dǎo)[11-13]?？?Jk3僅發(fā)生在Jk(a-b-)(又稱(chēng)Jknull)表型人群，波利尼亞和芬蘭人的Jk(a-b-)頻率約為0.1%～1.4%，亞洲地區(qū)日本約為0.002%，我國(guó)開(kāi)展的稀有血型篩查計(jì)劃報(bào)導(dǎo)新疆維吾爾地區(qū)少數(shù)民族Jk(a-b-)頻率為0.0063%、番禺地區(qū)50 034例無(wú)償獻(xiàn)血者中發(fā)現(xiàn)10例Jk(a-b-)，頻率為0.02%，深圳地區(qū)兒童Jk(a-b-)頻率為0.0196%，48 400上海地區(qū)人群中發(fā)現(xiàn)2例Jk(a-b-)，頻率為0.0041%。

Kidd血型系統(tǒng)為SLC14A1基因產(chǎn)物，由11個(gè)外顯子構(gòu)成。JKA與JKB基因多態(tài)性由G838A決定第280個(gè)氨基酸為天冬氨酸形成Jka抗原、天冬酰胺形成Jkb抗原。Jknull表型的分子機(jī)制中以342-1G>A相對(duì)常見(jiàn)，舊稱(chēng)IVS5-1，該位點(diǎn)突變位于內(nèi)含子5最后一個(gè)堿基，導(dǎo)致RNA剪切酶無(wú)法結(jié)合，使6外顯子全片段缺失[14]。在本實(shí)驗(yàn)的家系調(diào)查中，先證者與其子代都發(fā)生該位點(diǎn)突變。而先證者另一導(dǎo)致Jknull的堿基突變?yōu)?22C>A，即第74個(gè)氨基酸從天冬酰胺變賴(lài)氨酸。

綜上所述，對(duì)長(zhǎng)期多次輸血患者進(jìn)行嚴(yán)格執(zhí)行輸血前后效評(píng)價(jià)，可早期發(fā)現(xiàn)由輸血刺激產(chǎn)生的同種抗體，為患者后續(xù)制定合理有效的輸血策略提供依據(jù)[15-16]。雖然先證者為尿毒癥患者，缺少Hb及肌酐等腎功能損害關(guān)鍵指標(biāo)無(wú)法體現(xiàn)，但仍可從輸血后膽紅素的急劇上升發(fā)現(xiàn)患者存在大量紅細(xì)胞破壞現(xiàn)象。對(duì)于需要長(zhǎng)期多次輸血患者需進(jìn)行多抗原檢測(cè)及抗體篩查，可保障該類(lèi)患者輸血安全，提升用血質(zhì)量[17]。