基于TCGA數(shù)據(jù)庫研究NUF2基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義①

米寧寧 林延延 曹 潔 張金鐸 岳 平 孟文勃

(蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，占所有類型肝癌的90%以上，近年發(fā)病率明顯上升[1]。全球范圍內(nèi)超過50%肝癌發(fā)生在中國，且東南沿海地區(qū)發(fā)病率最高。HCC發(fā)生發(fā)展的主要因素包括肝硬化、病毒性肝炎、黃曲霉素和化學(xué)致癌物等，其中，慢性肝炎病毒感染是最重要因素[2-3]。對于無肝硬化和轉(zhuǎn)移的HCC患者，肝切除是目前首選且最有效的方法[4]。但大部分患者就診時已處于晚期，常合并并發(fā)癥及伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無法徹底治愈，需根據(jù)腫瘤特點(diǎn)、并發(fā)癥、腫瘤部位和臨床表現(xiàn)等多種因素綜合分析并進(jìn)行微創(chuàng)治療，包括射頻消融術(shù)、微波消融術(shù)、經(jīng)肝動脈化療栓塞和肝動脈放療性栓塞、基因分子靶向治療如索拉菲尼等[5-6]。血清甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是當(dāng)前HCC診斷常用指標(biāo)，但仍有約30%的HCC患者AFP水平正常。因此，深入研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找高靈敏度的生物學(xué)標(biāo)記物對HCC早期診斷及預(yù)后預(yù)測具有重要意義。細(xì)胞分裂相關(guān)基因NUF2具有穩(wěn)定著絲粒和保證染色體正確分離的作用，可保證細(xì)胞有絲分裂過程正常進(jìn)行[7]。當(dāng)腫瘤組織中NUF2異常表達(dá)，運(yùn)動蛋白無法形成紡錘體微管附件，紡錘體裝配檢查點(diǎn)無法被激活，導(dǎo)致染色體分離異常，從而影響正常有絲分裂過程[8]。本研究使用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)集分析NUF2基因在正常肝組織與HCC中的表達(dá)差異、與HCC患者臨床病理特征的相關(guān)性及其與HCC預(yù)后的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究HCC的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 從TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載HCC的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，包含50例正常肝組織和374例HCC組織，同時下載其臨床相關(guān)資料，采用R軟件和Perl語言預(yù)處理數(shù)據(jù)。

1.2數(shù)據(jù)集篩選和差異表達(dá)分析 剔除TCGA數(shù)據(jù)集中臨床病理參數(shù)不完整及缺乏預(yù)后隨訪資料的樣本，僅保留同時包含臨床參數(shù)和生存數(shù)據(jù)的樣本，利用Wilcoxon秩和檢驗確定NUF2基因在正常肝組織和HCC組織中的表達(dá)差異，采用R軟件(3.5.2)的“l(fā)imma”軟件包完成差異分析并繪制差異散點(diǎn)圖[9]。

1.3生存分析與臨床相關(guān)性分析 根據(jù)樣本中NUF2基因表達(dá)的中位值將NUF2分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用R軟件的“survival”軟件包進(jìn)行生存分析，采用“survminer”軟件包繪制生存曲線，單因素和多因素Cox風(fēng)險模型分析臨床參數(shù)與HCC預(yù)后的關(guān)系并計算風(fēng)險比(hazard ratio,HR)。

1.4基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA) 采用GSEA軟件(4.0.2)(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)進(jìn)行富集分析[10]。采用GSEA網(wǎng)站的MsigDB數(shù)據(jù)庫獲取c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt數(shù)據(jù)集，設(shè)置分析置換次數(shù)為1 000次,顯著富集基因集需滿足以下條件：錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates,FDR)<0.25,P<0.05。

2 結(jié)果

2.1NUF2在和正常肝組織和HCC組織中的表達(dá)差異 HCC組織中NUF2表達(dá)顯著高于正常肝組織(P<0.05)，見圖1。

2.2NUF2基因表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性分析 NUF2表達(dá)與HCC患者預(yù)后呈顯著相關(guān)，見圖2。

HCC患者5年生存率分別為高表達(dá)組37.9%、低表達(dá)45.3%。NUF2表達(dá)與HCC患者年齡、臨床分期、腫瘤分級及T分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與M分期、N分期相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。單因素Cox分析提示病理分期、T分期、M分期及NUF2基因表達(dá)水平與HCC預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox分析，結(jié)果顯示NUF2高表達(dá)是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。見表1。

2.3GSEA分析 GSEA分析結(jié)果表明，NUF2基因高表達(dá)組HCC樣本主要富集于細(xì)胞周期、PPAR信號通路、GNRH信號通路(圖4)。提示NUF2基因可能參與HCC發(fā)生發(fā)展的多個生物學(xué)過程。

圖1 HCC組織和正常肝組織中NUF2 mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of NUF2 mRNA in HCC tissue and normal liver tissue

圖2 NUF2基因mRNA表達(dá)與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性Fig.2 Correlation of NUF2 mRNA expression and prognosis in HCC patients

圖3 NUF2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Fig.3 Relationship between expression of NUF2 and clinicopathological characteristics

圖4 GSEA分析NUF2相關(guān)富集基因集Fig.4 GSEA analysis of NUF2 relatied enriched gene set with high expression of NUF2

3 討論

HCC是目前最常見肝臟腫瘤之一，嚴(yán)重影響人們的生命健康，肝切除是目前治療HCC的首選和最有效方法，但大部分HCC患者就診時已處于晚期，且常合并并發(fā)癥或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無法手術(shù)根治，因此，尋找新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)有望改善HCC患者預(yù)后。本研究采用TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫分析正常肝組織與HCC組織中NUF2基因表達(dá)差異并分析其表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NUF2高表達(dá)組預(yù)后明顯差于低表達(dá)組，單因素、多因素Cox分析表明NUF2基因可作為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。GSEA分析結(jié)果提示NUF2基因高表達(dá)組HCC樣本主要富集于細(xì)胞周期、PPAR信號通路、GNRH信號通路等。

細(xì)胞分裂相關(guān)基因NUF2作為NDC80復(fù)合體的重要組成部分,參與動粒-微管黏附，涉及細(xì)胞有絲分裂和腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要過程，腫瘤組織中NUF2異常表達(dá)可誘導(dǎo)有絲分裂細(xì)胞異常并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致腫瘤[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)NUF2可促進(jìn)細(xì)胞生長并抑制HCC細(xì)胞凋亡[13]。一項針對人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的研究表明，沉默NUF2表達(dá)可抑制人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖，有望成為靶向治療早期治療骨肉瘤的新策略[14]。通過siRNA干擾沉默技術(shù)抑制NUF2基因表達(dá)，結(jié)果表明NUF2低表達(dá)可顯著降低肝癌HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲[15]。

綜上所述，HCC組織中NUF2基因高表達(dá)，且與臨床病理特征相關(guān)，可能是HCC診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。本研究的優(yōu)勢在于利用TCGA數(shù)據(jù)庫中肝細(xì)胞癌的測序數(shù)據(jù)，納入樣本多，臨床資料比較完整，為后續(xù)研究NUF2基因在HCC中的發(fā)生機(jī)制及相關(guān)臨床研究提供依據(jù)。但不能完全代表NUF2在蛋白水平的表達(dá)，后續(xù)將采用qPCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法驗證NUF2的表達(dá)情況，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為HCC的基因靶向治療提供新思路。