樹突狀細胞上巨噬細胞半乳糖型凝集素在乳腺癌細胞識別中的作用研究①

卜慶盼 齊文靖 張麗嬌 倪秀珍 (長春師范大學生命科學學院，長春 130032)

乳腺癌作為一種惡性腫瘤，是全世界女性癌癥患者死亡的主要原因，且發(fā)病率逐年上升，成為威脅女性健康的第一致命殺手[1]。在乳腺癌研究中，腫瘤的進展和免疫系統(tǒng)之間的關系越來越受到重視[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-4]。例如，大多數(shù)癌癥患者組織內(nèi)DCs數(shù)量明顯減少，且存在功能缺陷。另有研究表明，腫瘤細胞在惡化的進程中，其表面的一些蛋白分子常常發(fā)生異常糖基化，如腫瘤細胞表面相關蛋白N連接多糖支鏈和唾液酸化程度提高，其相關蛋白O連接多糖側(cè)鏈不完全延伸等[5]。而異常糖基化的腫瘤抗原可利用DCs表面特異表達的C型凝集素受體(CLRs)，如DC-SIGN、Langerin、MR等，影響DCs的識別、分化、成熟及免疫調(diào)節(jié)功能，進而導致腫瘤細胞免疫逃逸[6-7]。

巨噬細胞半乳糖型凝集素(macrophages galec-tintype lectin，MGL)是表達在DCs或巨噬細胞表面的CLRs家族中的一員，其結(jié)構(gòu)主要由胞漿尾區(qū)、跨膜區(qū)、頸區(qū)和胞外碳水化合物結(jié)合(carbohydrate recognition domain，CRD)區(qū)構(gòu)成，為Ⅱ型跨膜蛋白。MGL的CRD區(qū)對末端帶有GalNAc聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白或糖脂的結(jié)合具有專一性[8]。MGL在絲狀病毒和曼氏血吸蟲等病原體的識別、DCs和T細胞的功能調(diào)節(jié)等過程中均具有重要作用[9-11]。已有研究表明MGL可以結(jié)合乳腺癌組織，但作用機理尚未闡明。本研究以乳腺癌細胞系MCF-7為實驗材料，采用流式細胞術、單糖抑制實驗、RT-PCR和Western blot等研究方法，探索了乳腺癌細胞系MCF-7同DCs表面C型凝集素MGL的結(jié)合情況，鑒定了MCF-7細胞表面的MGL配體，揭示了DCs上MGL在乳腺癌細胞識別中的作用，為乳腺癌的發(fā)生及免疫治療提供了新的理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 人乳腺癌細胞系MCF-7購自上海中科院細胞庫。

1.1.2主要試劑 人MGL重組蛋白、羊抗人MGL單克隆抗體購自美國R&D公司；bio-HPA(生物素化蝸牛凝集素)購自Sigma-Aldrich公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司；鼠抗人MUC1單克隆抗體由Henrik Clausen 教授(丹麥哥本哈根大學)饋贈；FITC標記的鏈霉親和素購自北京四正柏公司；FITC標記的山羊抗小鼠IgG購自武漢博士德生物有限公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物有限公司；細胞裂解液Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；膜蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物公司；Amaxa 細胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自Lonza公司；Ex-Taq酶購自大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞系MCF-7為貼壁生長細胞，用含有10%FBS和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2MGL糖配體鑒定 1 000 r/min離心5 min收取MCF-7細胞，100 μl PBS重懸細胞沉淀。實驗組中加入2 μl bio-HPA，室溫孵育30 min。PBS為對照組。隨后分別加入FITC標記的鏈霉親和素，室溫避光孵育30 min。FACS buffer洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min，500 μl FACS buffer重懸細胞沉淀，流式細胞儀進行檢測。

1.2.3配體結(jié)合實驗 1 000 r/min離心5 min收取MCF-7細胞，PBS進行洗滌。100 μl PBS重懸細胞于1.5 EP管中，細胞密度為1×105個/ml。實驗組加入重組MGL蛋白(2 μg/ml)，室溫孵育 30 min，PBS為對照組。然后分別加入anti-MGL、FITC標記的山羊抗小鼠IgG進行室溫避光孵育，時間分別為 30 min。FACS buffer 洗滌2次后離心，500 μl FACS buffer重懸細胞沉淀，流式細胞儀檢測MGL與MCF-7細胞的結(jié)合情況。

1.2.4抑制實驗 1 000 r/min離心5 min收取MCF-7細胞，PBS進行洗滌，100 μl PBS重懸細胞于1.5 EP管中，細胞密度為1×105個/ml。加入10 mmol/L EGTA或20 mmol/L GalNAc室溫孵育30 min，隨后分別加入MGL重組蛋白、anti-MGL、FITC標記的山羊抗小鼠IgG，室溫避光分別孵育30 min。FACS buffer洗滌兩次后，流式細胞術檢測MGL與MCF-7細胞的結(jié)合情況。以PBS為陰性對照組。

1.2.5RT-PCR 1 000 r/min離心收集MCF-7細胞，PBS洗滌細胞沉淀。每106個細胞加入1 ml Trizol進行裂解，隨后分別加入氯仿、異丙醇、乙醇進行抽提，獲得細胞RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將獲得的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到穩(wěn)定的cDNA。按照PCR反應體系(cDNA模板1 μl、無菌水13.2 μl、Taq buffer 2 μl、dNTP 1.6 μl、Ex-Taq 0.2 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl)配制PCR反應溶液，引物核苷酸序列見表1?；靹蚍磻芤汉笏矔r離心，使用PCR儀進行序列擴增。擴增條件如下：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)； 72℃再延伸5 min；20 ℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物加入上樣緩沖液后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，掃描成像。

1.2.6Western blot 離心收集MCF-7細胞，PBS洗滌細胞沉淀。加入預冷的全細胞裂解液，裂解30 min,每5 min渦旋振蕩1次，12 000 r/min離心15 min，上清液即為細胞全蛋白。加入等體積的SDS上樣緩沖液，沸水中煮5 min，分裝并于-80℃保存。將加入上樣緩沖液的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。TBST buffer搖床進行洗膜后，加入稀釋好的一抗，4℃緩慢搖動過夜。TBST buffer洗3次后加入稀釋好的二抗，室溫搖床上孵育60 min。TBST buffer漂洗后ECL 化學發(fā)光法曝光成像。

1.2.7免疫共沉淀 用碧云天膜蛋白提取試劑盒提取MCF-7細胞膜蛋白。取Protein G 瓊脂糖珠，加入PBS，14 000 r/min離心5 min，洗滌2次。將40 μl洗滌過的Protein G 瓊脂糖珠與膜蛋白裂解液在4℃ 旋轉(zhuǎn)混勻儀上共孵育3 h，然后 14 000 r/min

表1 目的基因核苷酸序列

離心2 min，取上清，預清除膜蛋白中與瓊脂糖珠結(jié)合的雜蛋白。取60 μl Protein G 瓊脂糖珠與4 μg anti-MUC1-Tn抗體相偶聯(lián)，4℃旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育3 h。加入預清除后的膜蛋白，4℃旋轉(zhuǎn)搖床上孵育過夜。隨后，14 000 r/min離心5 min，棄上清，并進行洗滌。最后加入SDS loading buffer煮樣，進行Western blot分析。

1.2.8RNA干涉 離心收取MCF-7細胞制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，接種于12孔板中。利用Amaxa細胞轉(zhuǎn)染試劑盒，嚴格根據(jù)說明對MCF-7細胞進行細胞轉(zhuǎn)染。MUC1 RNA干涉序列為：F 5′-GAAGGUUUCUGCAGGUAAUTT-3′,R 5′-AUUACCUGCAGAAACCUUCTT-3′；對照組RNA干涉序列為：F 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，R 5′-ACGUG-ACACGUUCGGAGAATT-3′。24 h后檢測細胞轉(zhuǎn)染效率。Western blot和FACS實驗進行后續(xù)功能分析。

1.3統(tǒng)計學分析 采用FlowJo 7.6.5 軟件對流式細胞術結(jié)果進行繪圖分析。采用GraphPad Prism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。定量分析采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1MCF-7細胞上高表達MGL糖配體GalNAc 研究報道，腫瘤細胞惡性化過程中會暴露出截短的O-連接聚糖，如Tn抗原，即末端GalNAc糖結(jié)構(gòu)[12]。且DCs上表達的C型凝集素MGL對含有GalNAc結(jié)構(gòu)的糖脂或糖蛋白的結(jié)合具有特異性。為了確定MGL是否在DCs識別乳腺癌細胞MCF-7的過程中發(fā)揮作用，本研究首先檢測了MCF-7細胞表面單糖GalNAc的表達情況。流式細胞術結(jié)果顯示，蝸牛凝集素(HPA，特異性識別GalNAc)能夠與乳腺癌細胞MCF-7高度結(jié)合(圖1A)，結(jié)合率高達80%以上。圖1B為3次重復實驗的結(jié)果統(tǒng)計。表明乳腺癌細胞表面高表達MGL糖配體GalNAc，即Tn抗原。

圖1 MCF-7細胞高表達MGL糖配體GalNAcFig.1 MCF-7 cells highly expressed GalNAc as MGL sugar ligandNote:Student′s t-test.**.P<0.01.Data are based on three independent experiments.

2.2MGL顯著性的高結(jié)合乳腺癌細胞MCF-7 為了進一步確定MGL和人乳腺癌胞MCF-7之間的關系，本研究采用PBS buffer重懸細胞，并與重組MGL蛋白共孵育，然后通過流式細胞儀檢測MGL同MCF-7細胞的結(jié)合情況。結(jié)果如圖2A所示，重組MGL蛋白能夠與MCF-7細胞高結(jié)合，其結(jié)合率為57.5%。MGL作為C型凝集素家族的一員，其與配體的結(jié)合常常需要鈣離子的輔助[11]。在MGL與MCF-7細胞的結(jié)合實驗體系中加入Ca2+螯合劑EGTA，發(fā)現(xiàn)EGTA可以顯著抑制MGL同MCF-7細胞的結(jié)合(圖2)。另外，單糖GalNAc的加入也可以競爭MGL同MCF-7細胞的結(jié)合，阻斷了MGL對乳腺癌細胞MCF-7的識別。圖2B為MGL與MCF-7細胞結(jié)合的流式結(jié)果統(tǒng)計圖。以上結(jié)果表明，C型凝集素MGL可以與乳腺癌細胞MCF-7高度結(jié)合，并且此結(jié)合是Ca2+和GalNAc依賴的。

2.3乳腺癌細胞MCF-7膜表面MUC1介導了其與MGL的相互作用 MGL與結(jié)腸癌組織中的黏蛋白MUC1高度結(jié)合[13]。體外重組的MUC1-Tn可以結(jié)合MGL進而影響DCs的內(nèi)化和遞呈功能。為闡明MUC1是否也存在于乳腺癌細胞MCF-7中，本研究利用RT-PCR和Western blot實驗分別在RNA和蛋白質(zhì)水平檢測了MCF-7細胞中MUC1的表達情況，Jurkat細胞為陽性對照。結(jié)果如圖3A、B所示，MCF-7細胞中表達MUC1，表明 MCF-7細胞中MUC1可能為MGL的配體。為證實上述猜測，采用MUC1的抗體對MCF-7細胞的膜蛋白進行免疫共沉淀，并用重組MGL-Fc蛋白進行Western blot分析。如圖3C所示，MGL能夠特異性結(jié)合MCF-7細胞膜表面的MUC1-Tn。通過RNA干涉實驗抑制MCF-7細胞中MUC1的表達后，流式細胞術結(jié)果顯示MGL與MCF-7細胞的結(jié)合下降(圖3D)。表明MUC1為乳腺癌細胞MCF-7中MGL的蛋白配體，介導了MGL與MCF-7細胞的相互作用。

圖2 MGL顯著高度結(jié)合乳腺癌細胞MCF-7Fig.2 MGL was significantly binded to breast cancer cell MCF-7Note:Untreated indicate the interaction between MGL and MCF-7 cells without inhibitor.Student′s t-test.Error bars,SEM;n=3 technical replicas.***.P<0.001.

圖3 MGL特異性識別MCF-7細胞上的MUC1Fig.3 MGL specifically recognized MUC1 in MCF-7 cellsNote:A.MUC1 RNA expression on MCF-7 cells；B.MUC1 protein expression on MCF-7 cells；C.MGL specifically recognized MUC1 on MCF-7 cells through immunoprecipitation；D.Interaction between MGL and MCF-7 cells was decreased by interfering with MUC1 expression on MCF-7 cells;NC.Negative control；PC.Positive control.

3 討論

腫瘤是機體惡變的產(chǎn)物，腫瘤細胞逃逸一直是長期困擾免疫學研究的難題之一。DCs作為體內(nèi)功能最強大的抗原遞呈細胞，為固有免疫和適應性免疫應答的中間橋梁，在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色，參與腫瘤抗原的識別、捕獲、加工和遞呈[14-15]。然而，隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，腫瘤細胞常通過多種機制抑制DCs的功能。如腫瘤細胞可通過分泌多種細胞因子和趨化因子等影響DCs的分化、成熟和遷移，進一步導致腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視。另外，腫瘤細胞異常糖基化修飾的抗原，利用DCs表面的C型凝集素干擾DCs的抗原識別，為腫瘤細胞免疫逃逸的另一主要原因[3]。在DCs參與的腫瘤免疫調(diào)節(jié)與應答中，關于特異性結(jié)合甘露糖和巖藻糖的C型凝集素MR和DC-SIGN的研究較多，但目前關于MGL的研究較少。雖有研究表明MGL可結(jié)合乳腺癌組織，但其作用機制尚不清楚。

MGL(也稱CD301、CLEC10A)的CRD結(jié)構(gòu)域中的QPD氨基酸基序展現(xiàn)了Gal/GalNAc結(jié)合的特異性[16]。本研究采用HPA染色實驗結(jié)合流式細胞術，證實乳腺癌細胞MCF-7表面高表達MGL的糖配體GalNAc，即Tn抗原，且MGL展現(xiàn)了與MCF-7細胞的高度結(jié)合能力。Ca2+和GalNAc的加入明顯抑制了MGL對MCF-7細胞的結(jié)合能力，表明MGL與MCF-7細胞的結(jié)合依賴于Ca2+和GalNAc。上述結(jié)果表明MGL在參與DCs對乳腺癌細胞的免疫識別中具有重要作用。

MUC樣黏蛋白家族為一類高分子量糖蛋白，含有大量O-連接聚糖。MUC1為已知21種MUC黏蛋白家族中的一種上皮糖蛋白，在大多數(shù)腺癌中表達上調(diào)，乳腺癌中MUC1表達上調(diào)比例超過90%。癌細胞中MUC1除表達量發(fā)生改變外，其糖基化修飾也會發(fā)生異常。癌變的情況下，MUC1常攜帶截短的O-連接多糖，MUC1 Tn、MUC1 STn、MUC1 T、MUC1 ST等為最常見的形式[17]。而Tn抗原恰巧是MGL的糖識別結(jié)構(gòu)域。本研究利用免疫沉淀、Western blot及RNA干擾等實驗驗證了MCF-7細胞上的糖蛋白MUC1為MGL的配體，介導了MGL和MCF-7細胞之間的相互作用。揭示C型凝集素MGL在乳腺癌細胞免疫識別中的作用。然而RNA干涉實驗反映：干涉乳腺癌細胞中MUC1的表達后，MGL與MCF-7細胞的結(jié)合能力下降，但仍有結(jié)合。因此，考慮除MUC1外，MCF-7細胞上可能還存在MGL的其他配體。MCF-7細胞與DCs上MGL結(jié)合后對DCs功能有何影響將是課題組下一步的工作重點。本研究為進一步揭示DCs在乳腺癌細胞免疫應答中的作用奠定了基礎。