• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    西紅花苷對缺血性腦卒中后抑郁大鼠炎癥反應(yīng)及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響①

    2021-02-23 12:41:04徐倩倩錢旭東竇志杰張雪茹
    中國免疫學(xué)雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:海馬水平

    徐倩倩 錢旭東 孫 凡 劉 恒 竇志杰 龔 靜 張雪茹

    (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,承德 067000)

    卒中后抑郁是腦卒中后常見的情感障礙,發(fā)病率較高,預(yù)后較差,且卒中后抑郁可誘發(fā)腦卒中再發(fā)以及其他血管相關(guān)事件。卒中后抑郁的發(fā)病機制復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)在卒中后抑郁的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1]。西紅花苷為一類水溶性類胡蘿卜素,具有抗炎、心血管保護、神經(jīng)保護、抗腫瘤等多種藥理活性[2]。陳欣宇等[3]研究發(fā)現(xiàn)卒中后抑郁大鼠腦組織IL-1水平升高,西紅花苷可降低腦組織IL-1水平,通過抗炎作用發(fā)揮改善卒中后抑郁大鼠的抑郁癥狀。但西紅花苷對卒中后抑郁腦組織中其他炎癥因子的影響及其抗炎的可能機制目前少有報道。本文研究西紅花苷對腦卒中后抑郁大鼠腦組織IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平及Toll樣受體4/髓樣分化蛋白88/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(TLR4/MyD88/NF-κB)信號通路的影響,進一步探討西紅花苷對腦卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀的緩解作用及可能機制。

    1 材料與方法

    1.1材料 健康、雌雄各半、清潔級、體重200~220 g SD大鼠購自北京市醫(yī)療器械檢驗所,許可證號:SYXK(京)2015-0005,動物購回后在承德醫(yī)學(xué)院動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼養(yǎng)籠飼養(yǎng),自由進食進水。西紅花苷(源葉生物公司,純度99%,批號:111588-201812);蘇木素(南京建成生物工程研究所);兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠MyD88多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗體、兔抗鼠P65多克隆抗體、兔抗鼠p-P65多克隆抗體、兔抗鼠I-κBα多克隆抗體、兔抗鼠p-I-κBα多克隆抗體(美國Sigma公司);IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所);Olympus BX51顯微鏡(日本奧林巴斯);Tanon電泳儀(上海天能科技有限公司)。

    1.2方法

    1.2.1分組 將72只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為對照組(C組)、模型組(M組)、西紅花苷組(CR組),每組24只。

    1.2.2腦卒中模型建立 M組和CR組大鼠采用KoiZumi法建立腦卒中大鼠模型[4]。水合氯醛麻醉大鼠,取頸前正中切口,暴露,分離頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸總動脈主干和頸外動脈近端,動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈,頸總動脈分叉處剪開一小口,插入線栓,插入線栓長度約18~20 mm,建立局灶性腦缺血改變,結(jié)扎頸內(nèi)動脈,逐層縫合。對照組大鼠不插入線栓,其他步驟同模型組。建模24 h內(nèi),采用Longa 5分法評定大鼠神經(jīng)功能,行為正常者為0分;提起大鼠對側(cè)前肢內(nèi)收、內(nèi)旋者為1分;擠壓大鼠兩側(cè),對側(cè)抵抗力下降者為2分;大鼠圍繞手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈者記3分;無法自主活動者記4分[5]。0分和4分大鼠棄之不用,取正常大鼠重新按上述方法建模以補充。實驗過程中觀察各組大鼠每天進食、飲水、毛色、活動度、逃避反應(yīng)等情況。實驗過程中死亡大鼠則另取正常大鼠按照同樣方法以補充。

    1.2.3腦卒中后抑郁模型建立 M組和CR組大鼠腦卒中建模后7 d開始,按照慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激建立腦卒中后抑郁模型,慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激包括:禁水17 h、禁食20 h、持續(xù)光照17 h、傾斜鼠籠45°17 h、濕籠21 h、水平搖晃5 min、4℃游泳5 min、夾尾1 min、行為限制2 h[6]。以上刺激每日隨機采用1種,相鄰兩天刺激不相同,結(jié)合單獨飼養(yǎng),共21 d,建立腦卒中后抑郁模型,C組大鼠群籠正常環(huán)境飼養(yǎng)。建模大鼠糖水消耗實驗和曠場試驗結(jié)果與未建模大鼠有顯著性差異表示建模成功。

    1.2.4給藥方式 慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激期間CR組大鼠腹腔注射西紅花苷(50 mg/kg),1次/d,至應(yīng)激刺激結(jié)束[7]。C組和M組大鼠按照相同方法腹腔注射等量生理鹽水。

    1.2.5體重檢測 分別予應(yīng)激前和應(yīng)激后稱取各組大鼠體重。

    1.2.6糖水適應(yīng)實驗 先給予大鼠糖水訓(xùn)練檢測其基線值:第1天內(nèi)給予2瓶1%蔗糖水,第2天內(nèi)給予1瓶蔗糖水、1瓶礦泉水,禁食禁水23 h,測接下來1 h糖水消耗,即給予1瓶蔗糖水和1瓶礦泉水。統(tǒng)計糖水偏嗜比(SP)(SP=糖水?dāng)z入量/糖水和礦泉水總攝入量×100%)。然后給予2 h正常飲食飲水,禁食禁水 21 h,測1 h糖水消耗,以最后1次SP為基線值,排除SP<60%大鼠,取正常大鼠重新建模補充。分別測量各組大鼠應(yīng)激前和應(yīng)激后SP值。

    1.2.7曠場試驗 采用80 cm×80 cm×60 cm敞箱進行曠場試驗。將箱底面分為面積相等的25塊,大鼠在底面進行水平活動,若靠邊行走,則穿越1格為1次,若按直徑方向走,10 cm為1次。垂直得分為大鼠雙前爪離開底面再落到底面為1次。分別與應(yīng)激前和應(yīng)激后,觀察5 min內(nèi)各大鼠水平運動次數(shù)和垂直運動次數(shù)。

    1.2.8取材 曠場試驗結(jié)束后,每組取12只大鼠進行心臟灌流,至腹腔內(nèi)臟器由紅色變?yōu)樯n白色、左心房流出液為無色時改用多聚甲醛繼續(xù)灌注固定腦組織,至大鼠四肢完全變硬后停止灌流,斷頭取出腦組織,多聚甲醛固定4 h,常規(guī)進行石蠟包埋,制成 4 μm石蠟切片。每組剩余12只大鼠水合氯醛麻醉,在冰盤上快速開顱取腦,分離海馬組織,將其分為2份,一份用于ELISA測定,一份用于Western blot測定。

    1.2.9ELISA測定腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 將海馬組織在冰浴環(huán)境下研磨勻漿,15 000 r/min 離心20 min,取上清液,ELISA測定腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

    1.2.10免疫組化測定腦組織TLR4、MyD88、NF-κB表達 取海馬最大的冠面切片進行免疫組化染色:將海馬組織石蠟切片脫蠟、水化,枸櫞酸修復(fù)緩沖液高壓熱修復(fù)抗原,置于過氧化氫中孵育10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗,加入一抗:兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠MyD88多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(1∶200)過夜孵育,PBS液沖洗,加入抗兔抗體酶復(fù)合物孵育30 min,PBS液沖洗,DAB顯色10 min,流水沖洗,蘇木素復(fù)染2 min,PBS液沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗。胞漿呈棕黃色為陽性細(xì)胞。鏡下觀察200倍視野下CA1區(qū)免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)。

    1.2.11Western blot測定各組大鼠腦組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平 取大鼠海馬組織加入RIPA裂解液冰浴中勻漿,收集總蛋白,考馬斯亮藍法測定蛋白總量,經(jīng)電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,加入一抗:兔抗鼠P65多克隆抗體(1∶300)、兔抗鼠p-P65多克隆抗體(1∶300)、兔抗鼠I-κBα多克隆抗體(1∶300)、兔抗鼠p-I-κBα多克隆抗體(1∶300),過夜孵育,加入二抗(1∶2 000)孵育2 h,ECL發(fā)光劑發(fā)光,膠片上曝光,經(jīng)顯影定影后,采用Quantity One軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參。目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

    2 結(jié)果

    2.13組大鼠一般狀態(tài) C組大鼠進食、飲水、毛色、活動度均正常;M組大鼠進食、飲水減少,毛色差、活動量明顯減少,無明顯逃避反應(yīng);CR組大鼠進食、飲水、毛色、活動度及逃避反應(yīng)均較M組改善。整個實驗過程中共死亡15只大鼠,均另取正常大鼠按照同樣方法處理以補充。

    2.23組大鼠體重比較 應(yīng)激前,3組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.074,P=0.929);應(yīng)激后,3組大鼠體重差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.672,P<0.001),M組大鼠體重低于C組,CR組大鼠體重高于M組。見圖1。

    2.33組大鼠SP比較 應(yīng)激前,3組大鼠SP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.130,P=0.878);應(yīng)激后,3組大鼠SP差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=214.307,P<0.001),M組大鼠SP低于C組,CR組大鼠SP高于M組。見圖2。

    2.43組大鼠水平運動次數(shù)比較 應(yīng)激前,3組大鼠水平運動次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.049,P=0.952); 應(yīng)激后,3組大鼠水平運動次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=115.912,P<0.001),M組大鼠水平運動次數(shù)低于C組,CR組大鼠水平運動次數(shù)高于M組。見圖3。

    圖1 3組大鼠應(yīng)激前后體重比較Fig.1 Comparison of body weight before and after stress in three groups of ratsNote:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    2.53組大鼠垂直運動次數(shù)比較 應(yīng)激前,3組大鼠垂直運動次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.355,P=0.702);應(yīng)激后,3組大鼠垂直運動次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.910,P<0.001),M組大鼠垂直運動次數(shù)低于C組,CR組大鼠垂直運動次數(shù)高于M組。見圖4。

    2.63組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 應(yīng)激后,3組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于C組,CR組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于M組。見表1。

    2.7各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB免疫組化表達 應(yīng)激后,3組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)高于C組,CR組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)低于M組。見表2、圖5~7。

    圖2 3組大鼠應(yīng)激前后SP比較Fig.2 Comparison of SP before and after stress in three groups of ratsNote:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    圖3 3組大鼠應(yīng)激前后水平運動次數(shù)比較 Fig.3 Comparison of horizontal exercises number before and after stress in three groups of ratsNote:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    圖4 3組大鼠應(yīng)激前后垂直運動次數(shù)比較(次/5 min)Fig.4 Comparison of vertical movements number before and after stress in three groups of rats(number/5 min)Note:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    圖5 免疫組化測定3組大鼠海馬組織TLR4表達(×200)Fig.5 TLR4 expression in hippocampus tissue of three groups of rats by immunohistochemistry(×200)

    圖6 免疫組化測定3組大鼠海馬組織MyD88表達(×200)Fig.6 MyD88 expression in hippocampus tissue of three groups of rats by immunohistochemistry(× 200)

    圖7 免疫組化測定3組大鼠海馬組織NF-κB表達(×200)Fig.7 NF-κB expression in hippocampus tissue of three groups of rats by immunohistochemistry(×200)

    表1 3組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

    表2 3組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較

    表3 3組大鼠海馬組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平比較

    圖8 Western blot測定各組大鼠海馬組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平Fig.8 Western blot determination of P65,p-P65,I-κBα,and p-I-κBα protein levels in hippocampus tissue of rats in each group

    2.83組大鼠海馬組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平比較 3組大鼠海馬組織P65、I-κBα蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);3組大鼠海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M組大鼠海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平高于C組,CR組大鼠海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平低于M組。見表3、圖8。

    3 討論

    腦卒中后抑郁為腦卒中后比較嚴(yán)重的一類并發(fā)癥,大約1/3的腦卒中患者會出現(xiàn)腦卒中后抑郁。腦卒中后抑郁為一類慢性疾病,患者往往出現(xiàn)失望、悲觀、對治療失去信心、絕食及自殺傾向,從而對患者的預(yù)后帶來不良影響。腦卒中后抑郁的發(fā)病機制復(fù)雜,近年來研究已證實腦卒中后抑郁患者抑郁行為的發(fā)生是由促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的,腦卒中可引起IL-1β、IL-6、TNF-α等多種促炎因子水平升高,這些炎癥因子和內(nèi)分泌功能、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、突觸可塑性等病理生理過程關(guān)系密切[6-8]。下丘腦-垂體-腎上腺軸異常和抑郁癥的發(fā)生關(guān)系密切,下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活是抵御應(yīng)激的內(nèi)分泌機制之一;IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子是引起下丘腦-垂體-腎上腺素軸改變的潛在因素之一,其可引起皮質(zhì)醇和乙酰膽堿水平升高,影響去甲腎上腺素活性。炎癥細(xì)胞因子水平升高還可引起吲哚胺-2,3-雙加氧酶升高,導(dǎo)致腦組織5-HT含量下降,從而誘發(fā)抑郁癥狀的發(fā)生。如WEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)腦卒中誘發(fā)的炎癥反應(yīng)與腦卒中后抑郁的關(guān)系密切;JIAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)IL-6與腦卒中后抑郁的患病風(fēng)險呈正相關(guān),可以預(yù)測腦卒中后抑郁的預(yù)后;WIUM-ANDERSEN等[11]研究發(fā)現(xiàn)抗炎治療可降低腦卒中后抑郁的患病風(fēng)險。由此可見,抑制炎癥反應(yīng)對腦卒中后抑郁具有防治作用。

    炎癥反應(yīng)可由多種信號通路介導(dǎo),TLR4/MyD88/NF-κB信號通路為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要信號通路之一。TLRs為Ⅰ型跨膜蛋白,其和配體結(jié)合可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)同源區(qū)募集接頭蛋白,從而活化炎癥反應(yīng),產(chǎn)生一系列炎癥因子[12-16]。TLR4為研究最廣泛的一種,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,TLR4主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達。腦損傷時產(chǎn)生的內(nèi)源性配體可激活TLR4,活化的TLR4通過MyD88依賴性信號通路激活NF-κB。在MyD88依賴性信號途徑中,MyD88與IL-1受體相關(guān)激酶結(jié)合,激活TNF受體相關(guān)因子-6,使I-κKɑ/β磷酸化被激活,從而進一步激活NF-κB,NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等一系列炎癥因子,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。

    西紅花苷來源于番紅花、梔子花,具有抗腫瘤、抗血栓、調(diào)節(jié)免疫功能、保護神經(jīng)元、抗神經(jīng)炎癥等多種作用。大量研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷在多種炎癥相關(guān)性疾病中發(fā)揮抗炎作用,如LI等[12]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng);YARIJANI等[13]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對缺血再灌注引起腎臟損傷的保護作用;SHAFAHI等[14]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷通過抗炎作用抑制海馬神經(jīng)元凋亡;LIU等[15]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷對大鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有抗炎和抗關(guān)節(jié)炎作用。西紅花苷可通過NF-κB信號通路發(fā)揮作用,如FU等[18]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷通過抑制NF-κB信號通路激活來抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收;DU等[19]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷可通過抑制NF-κB信號激活減少煙曲霉誘導(dǎo)的氣道炎癥;LI等[20]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷可抑制NF-κB信號通路引起的炎癥反應(yīng),發(fā)揮對足細(xì)胞的保護作用。

    本文通過建立腦卒中后抑郁大鼠模型,并給予西紅花苷治療,發(fā)現(xiàn)西紅花苷可改善腦卒中后抑郁大鼠的抑郁癥狀,降低海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平。表明西紅花苷可能通過抑制腦組織炎癥反應(yīng)緩解腦卒中后抑郁大鼠的抑郁癥狀。介于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,西紅花苷可通過NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng),因此推測西紅花苷可能通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮抗抑郁作用。本文對其進行研究,發(fā)現(xiàn)西紅花苷可降低腦卒中后抑郁大鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF-κB表達,降低海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平。p-P65為NF-κB的活化形式,p-P65水平降低表明NF-κB的活化被抑制;I-κBα本身具有抑制NF-κB活化的作用,I-κBα降解可導(dǎo)致NF-κB進入細(xì)胞核內(nèi)活化,啟動下游因子表達,抑制I-κBα降解,可抑制I-κBα磷酸化過程,降低p-I-κBα水平,從而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活化水平[21]。故本研究結(jié)果表明西紅花苷具有抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活的作用,由此推測西紅花苷可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活抑制腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而發(fā)揮對腦卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀的改善作用。

    綜上所述,西紅花苷具有抑制腦卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀的作用,其機制可能為西紅花苷通過抑制腦組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng),從而抑制抑郁癥狀的發(fā)生。

    猜你喜歡
    海馬水平
    海馬
    張水平作品
    作家葛水平
    火花(2019年12期)2019-12-26 01:00:28
    海馬
    加強上下聯(lián)動 提升人大履職水平
    “海馬”自述
    老虎獻臀
    小海馬和海馬爸爸
    大灰狼(2015年6期)2015-07-16 21:01:00
    海馬
    做到三到位 提升新水平
    中國火炬(2010年8期)2010-07-25 11:34:30
    国产成人精品福利久久| 日韩国内少妇激情av| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美日韩精品成人综合77777| 黑人猛操日本美女一级片| 一本久久精品| 成年av动漫网址| 97超碰精品成人国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧洲国产日韩| 一区二区三区四区激情视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美日韩在线观看h| 国产高清国产精品国产三级 | 国产精品国产av在线观看| 免费av不卡在线播放| 国产一区二区在线观看日韩| 视频中文字幕在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 五月开心婷婷网| 精品人妻视频免费看| 成人影院久久| a级毛色黄片| 国产伦精品一区二区三区四那| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久99热这里只有精品18| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 婷婷色av中文字幕| 免费看光身美女| 国产一区二区三区av在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 丰满乱子伦码专区| 秋霞在线观看毛片| 欧美人与善性xxx| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产综合精华液| 人妻系列 视频| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久九九精品二区国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 成人二区视频| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 嘟嘟电影网在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产精品无大码| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| 一区二区三区四区激情视频| 久久99精品国语久久久| 国产极品天堂在线| 七月丁香在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产视频首页在线观看| 青青草视频在线视频观看| av国产精品久久久久影院| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| a 毛片基地| 18禁动态无遮挡网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 99久久精品一区二区三区| 国产在线视频一区二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 最近最新中文字幕大全电影3| 色网站视频免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 联通29元200g的流量卡| 男人舔奶头视频| 亚洲欧洲日产国产| 久久人人爽人人片av| 熟女av电影| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品精品国产色婷婷| 久久99热6这里只有精品| 91狼人影院| 街头女战士在线观看网站| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲av不卡在线观看| 精品酒店卫生间| 26uuu在线亚洲综合色| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲人成网站在线播| 看十八女毛片水多多多| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品人妻视频免费看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久国产一区二区| 国产美女午夜福利| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品av视频在线免费观看| 99久久综合免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产精品一区三区| 18禁动态无遮挡网站| 欧美最新免费一区二区三区| 有码 亚洲区| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 一级a做视频免费观看| 免费黄色在线免费观看| 免费大片黄手机在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲成人手机| 久久婷婷青草| 免费观看a级毛片全部| 天天躁日日操中文字幕| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品日韩av片在线观看| 好男人视频免费观看在线| 丝袜喷水一区| 国产精品无大码| 91精品伊人久久大香线蕉| 最近最新中文字幕大全电影3| 1000部很黄的大片| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产成人a区在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 又爽又黄a免费视频| 三级国产精品欧美在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久精品国产a三级三级三级| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 一本色道久久久久久精品综合| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产在线男女| 草草在线视频免费看| 婷婷色综合www| 秋霞伦理黄片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人一区二区在线| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 永久免费av网站大全| 舔av片在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 少妇的逼好多水| 国产精品一二三区在线看| 五月开心婷婷网| 日韩三级伦理在线观看| 成年免费大片在线观看| 熟女电影av网| 校园人妻丝袜中文字幕| 联通29元200g的流量卡| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成人一区二区视频在线观看| 观看av在线不卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久亚洲国产成人精品v| 成人国产麻豆网| 国产精品熟女久久久久浪| 91精品一卡2卡3卡4卡| av国产免费在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久av网站| 亚洲av成人精品一二三区| 老司机影院成人| 伦精品一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 欧美成人精品欧美一级黄| www.av在线官网国产| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美3d第一页| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 天天躁日日操中文字幕| 尾随美女入室| 美女国产视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩综合久久久久久| 一级a做视频免费观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 日韩强制内射视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 男人舔奶头视频| 99久久综合免费| 久久久精品免费免费高清| av免费观看日本| 春色校园在线视频观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲,欧美,日韩| 久久久久久伊人网av| 亚洲国产色片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 热99国产精品久久久久久7| 色5月婷婷丁香| 国产成人91sexporn| 国产精品99久久99久久久不卡 | 午夜视频国产福利| 99热网站在线观看| 亚洲成人一二三区av| 欧美三级亚洲精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品久久久噜噜| 亚洲美女黄色视频免费看| 一级毛片我不卡| 国产伦理片在线播放av一区| 久久人人爽人人爽人人片va| av在线app专区| 乱码一卡2卡4卡精品| 尾随美女入室| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产一级毛片在线| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产精品999| 我的女老师完整版在线观看| 91精品国产九色| 国产精品一区二区性色av| 综合色丁香网| 国产在线男女| 成人国产av品久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 这个男人来自地球电影免费观看 | 六月丁香七月| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| av线在线观看网站| 免费观看a级毛片全部| 在线免费十八禁| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久精品94久久精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久久久精品性色| 人体艺术视频欧美日本| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产欧美日韩精品一区二区| 美女国产视频在线观看| 91精品国产九色| 在线观看av片永久免费下载| 我要看黄色一级片免费的| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久人人爽人人爽人人片va| 观看免费一级毛片| 久久久久精品久久久久真实原创| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品久久久久久av不卡| 高清视频免费观看一区二区| 精品一区在线观看国产| 成人综合一区亚洲| 一级毛片 在线播放| 免费看av在线观看网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| videossex国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 麻豆国产97在线/欧美| 丝瓜视频免费看黄片| 日本与韩国留学比较| 老司机影院成人| 黄色日韩在线| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品三级大全| 中文在线观看免费www的网站| 精华霜和精华液先用哪个| 国产成人aa在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 熟女av电影| xxx大片免费视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产在视频线精品| 亚洲成色77777| 日韩成人av中文字幕在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩中文字幕视频在线看片 | 2018国产大陆天天弄谢| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 色视频www国产| 亚洲欧美精品自产自拍| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲欧美日韩东京热| 一级毛片电影观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 大片电影免费在线观看免费| 国产 一区 欧美 日韩| 黄片wwwwww| 免费黄色在线免费观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 最近手机中文字幕大全| .国产精品久久| 国精品久久久久久国模美| 精品一品国产午夜福利视频| 国产亚洲欧美精品永久| 免费少妇av软件| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产乱人偷精品视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 香蕉精品网在线| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久色成人| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久国产网址| 久久99热这里只频精品6学生| 熟女av电影| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品国产成人久久av| 一级爰片在线观看| 久久久成人免费电影| 国产精品蜜桃在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 99热全是精品| 日本与韩国留学比较| 午夜激情福利司机影院| 国产永久视频网站| 国产 精品1| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久午夜福利片| www.av在线官网国产| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 青春草视频在线免费观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产高清三级在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 1000部很黄的大片| 丝袜脚勾引网站| 午夜福利网站1000一区二区三区| 在线免费十八禁| av在线蜜桃| 国产精品久久久久成人av| 高清午夜精品一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 最近中文字幕2019免费版| 天天躁日日操中文字幕| 99精国产麻豆久久婷婷| av卡一久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 毛片一级片免费看久久久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费观看无遮挡的男女| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 免费观看av网站的网址| 男人爽女人下面视频在线观看| 在线看a的网站| 国产亚洲精品久久久com| 免费观看av网站的网址| 国产淫片久久久久久久久| 国产免费福利视频在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 永久免费av网站大全| 在线免费十八禁| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 午夜福利在线在线| 一级av片app| av播播在线观看一区| 干丝袜人妻中文字幕| 国产一区二区三区av在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲天堂av无毛| 成人二区视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成年av动漫网址| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品国产亚洲av天美| 精品国产乱码久久久久久小说| 超碰97精品在线观看| 国产极品天堂在线| 免费看av在线观看网站| 少妇丰满av| 国产久久久一区二区三区| 一区二区av电影网| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 少妇的逼好多水| 午夜免费观看性视频| 成人特级av手机在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 一级片'在线观看视频| 日韩电影二区| 青春草亚洲视频在线观看| 在线播放无遮挡| 天堂8中文在线网| 亚洲无线观看免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 少妇高潮的动态图| 好男人视频免费观看在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产视频内射| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 久久久午夜欧美精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲真实伦在线观看| 一级av片app| 精品国产乱码久久久久久小说| 高清毛片免费看| 精品久久久久久电影网| 久久久久久久亚洲中文字幕| 九色成人免费人妻av| 午夜免费观看性视频| av一本久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 91在线精品国自产拍蜜月| 大香蕉久久网| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品.久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费观看在线日韩| 午夜激情福利司机影院| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲美女搞黄在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本欧美视频一区| 97在线视频观看| 亚洲无线观看免费| 国产精品久久久久久av不卡| 日本黄大片高清| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品,欧美精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 美女中出高潮动态图| 日韩强制内射视频| 精品酒店卫生间| 插阴视频在线观看视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久综合国产亚洲精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产片特级美女逼逼视频| 男人舔奶头视频| 91精品国产九色| 亚洲国产精品专区欧美| 国产欧美日韩精品一区二区| 天美传媒精品一区二区| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜福利在线在线| 久久久久久人妻| av免费在线看不卡| 国产欧美日韩精品一区二区| 晚上一个人看的免费电影| 欧美+日韩+精品| 六月丁香七月| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 一级毛片我不卡| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品人妻久久久影院| 国产成人午夜福利电影在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产中年淑女户外野战色| 最黄视频免费看| 观看免费一级毛片| 舔av片在线| 一个人看的www免费观看视频| 女性被躁到高潮视频| 午夜福利在线在线| 99久久人妻综合| 各种免费的搞黄视频| 蜜桃在线观看..| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美xxⅹ黑人| 色视频www国产| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久人妻熟女aⅴ| 免费黄色在线免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美一级a爱片免费观看看| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲av二区三区四区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品人妻视频免费看| 老女人水多毛片| 久久久精品94久久精品| 网址你懂的国产日韩在线| 99久国产av精品国产电影| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久久久久人妻| 97热精品久久久久久| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 人妻 亚洲 视频| 国产精品欧美亚洲77777| 另类亚洲欧美激情| 我要看日韩黄色一级片| 国产午夜精品一二区理论片| 国产男女内射视频| 丝袜喷水一区| 免费观看a级毛片全部| 三级国产精品片| 国产极品天堂在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品一区二区免费观看| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲人成网站在线观看播放| 男女国产视频网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲国产精品一区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 综合色丁香网| 伊人久久精品亚洲午夜| 色视频在线一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 亚洲最大成人中文| 在线观看免费高清a一片| av天堂中文字幕网| 性色avwww在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品一区二区性色av| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久亚洲精品成人影院| 51国产日韩欧美| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品久久久久久精品古装| 国产一区二区在线观看日韩| 国产久久久一区二区三区| 99热网站在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产永久视频网站| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品三级大全| 亚洲成色77777| 久久久久精品性色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产 精品1| 美女主播在线视频| 日韩视频在线欧美| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲av在线观看美女高潮| 久久ye,这里只有精品| 三级经典国产精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| www.色视频.com| 久久av网站| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩电影二区| 大片免费播放器 马上看| 国产精品国产三级专区第一集| 国产色爽女视频免费观看| 观看美女的网站| 边亲边吃奶的免费视频| 久久精品国产亚洲av天美| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 免费少妇av软件| 搡老乐熟女国产| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品.久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美日本视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 观看av在线不卡| 少妇的逼水好多| 日本一二三区视频观看| 婷婷色综合大香蕉| 少妇的逼水好多| 我要看黄色一级片免费的| 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费看不卡的av| 国内精品宾馆在线| 精品国产三级普通话版| 久久这里有精品视频免费| 最后的刺客免费高清国语| 久久国产乱子免费精品| 中文在线观看免费www的网站| 国产黄片视频在线免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产爽快片一区二区三区| 久久影院123| 两个人的视频大全免费| 直男gayav资源| 视频中文字幕在线观看| 22中文网久久字幕| 老女人水多毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 制服丝袜香蕉在线| 99久久人妻综合|