• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    西紅花苷對缺血性腦卒中后抑郁大鼠炎癥反應(yīng)及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響①

    2021-02-23 12:41:04徐倩倩錢旭東竇志杰張雪茹
    中國免疫學(xué)雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:海馬水平

    徐倩倩 錢旭東 孫 凡 劉 恒 竇志杰 龔 靜 張雪茹

    (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,承德 067000)

    卒中后抑郁是腦卒中后常見的情感障礙,發(fā)病率較高,預(yù)后較差,且卒中后抑郁可誘發(fā)腦卒中再發(fā)以及其他血管相關(guān)事件。卒中后抑郁的發(fā)病機制復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)在卒中后抑郁的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1]。西紅花苷為一類水溶性類胡蘿卜素,具有抗炎、心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤等多種藥理活性[2]。陳欣宇等[3]研究發(fā)現(xiàn)卒中后抑郁大鼠腦組織IL-1水平升高,西紅花苷可降低腦組織IL-1水平,通過抗炎作用發(fā)揮改善卒中后抑郁大鼠的抑郁癥狀。但西紅花苷對卒中后抑郁腦組織中其他炎癥因子的影響及其抗炎的可能機制目前少有報道。本文研究西紅花苷對腦卒中后抑郁大鼠腦組織IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平及Toll樣受體4/髓樣分化蛋白88/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(TLR4/MyD88/NF-κB)信號通路的影響,進(jìn)一步探討西紅花苷對腦卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀的緩解作用及可能機制。

    1 材料與方法

    1.1材料 健康、雌雄各半、清潔級、體重200~220 g SD大鼠購自北京市醫(yī)療器械檢驗所,許可證號:SYXK(京)2015-0005,動物購回后在承德醫(yī)學(xué)院動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼養(yǎng)籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食進(jìn)水。西紅花苷(源葉生物公司,純度99%,批號:111588-201812);蘇木素(南京建成生物工程研究所);兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠MyD88多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗體、兔抗鼠P65多克隆抗體、兔抗鼠p-P65多克隆抗體、兔抗鼠I-κBα多克隆抗體、兔抗鼠p-I-κBα多克隆抗體(美國Sigma公司);IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所);Olympus BX51顯微鏡(日本奧林巴斯);Tanon電泳儀(上海天能科技有限公司)。

    1.2方法

    1.2.1分組 將72只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為對照組(C組)、模型組(M組)、西紅花苷組(CR組),每組24只。

    1.2.2腦卒中模型建立 M組和CR組大鼠采用KoiZumi法建立腦卒中大鼠模型[4]。水合氯醛麻醉大鼠,取頸前正中切口,暴露,分離頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸總動脈主干和頸外動脈近端,動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈,頸總動脈分叉處剪開一小口,插入線栓,插入線栓長度約18~20 mm,建立局灶性腦缺血改變,結(jié)扎頸內(nèi)動脈,逐層縫合。對照組大鼠不插入線栓,其他步驟同模型組。建模24 h內(nèi),采用Longa 5分法評定大鼠神經(jīng)功能,行為正常者為0分;提起大鼠對側(cè)前肢內(nèi)收、內(nèi)旋者為1分;擠壓大鼠兩側(cè),對側(cè)抵抗力下降者為2分;大鼠圍繞手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈者記3分;無法自主活動者記4分[5]。0分和4分大鼠棄之不用,取正常大鼠重新按上述方法建模以補充。實驗過程中觀察各組大鼠每天進(jìn)食、飲水、毛色、活動度、逃避反應(yīng)等情況。實驗過程中死亡大鼠則另取正常大鼠按照同樣方法以補充。

    1.2.3腦卒中后抑郁模型建立 M組和CR組大鼠腦卒中建模后7 d開始,按照慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激建立腦卒中后抑郁模型,慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激包括:禁水17 h、禁食20 h、持續(xù)光照17 h、傾斜鼠籠45°17 h、濕籠21 h、水平搖晃5 min、4℃游泳5 min、夾尾1 min、行為限制2 h[6]。以上刺激每日隨機采用1種,相鄰兩天刺激不相同,結(jié)合單獨飼養(yǎng),共21 d,建立腦卒中后抑郁模型,C組大鼠群籠正常環(huán)境飼養(yǎng)。建模大鼠糖水消耗實驗和曠場試驗結(jié)果與未建模大鼠有顯著性差異表示建模成功。

    1.2.4給藥方式 慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激期間CR組大鼠腹腔注射西紅花苷(50 mg/kg),1次/d,至應(yīng)激刺激結(jié)束[7]。C組和M組大鼠按照相同方法腹腔注射等量生理鹽水。

    1.2.5體重檢測 分別予應(yīng)激前和應(yīng)激后稱取各組大鼠體重。

    1.2.6糖水適應(yīng)實驗 先給予大鼠糖水訓(xùn)練檢測其基線值:第1天內(nèi)給予2瓶1%蔗糖水,第2天內(nèi)給予1瓶蔗糖水、1瓶礦泉水,禁食禁水23 h,測接下來1 h糖水消耗,即給予1瓶蔗糖水和1瓶礦泉水。統(tǒng)計糖水偏嗜比(SP)(SP=糖水?dāng)z入量/糖水和礦泉水總攝入量×100%)。然后給予2 h正常飲食飲水,禁食禁水 21 h,測1 h糖水消耗,以最后1次SP為基線值,排除SP<60%大鼠,取正常大鼠重新建模補充。分別測量各組大鼠應(yīng)激前和應(yīng)激后SP值。

    1.2.7曠場試驗 采用80 cm×80 cm×60 cm敞箱進(jìn)行曠場試驗。將箱底面分為面積相等的25塊,大鼠在底面進(jìn)行水平活動,若靠邊行走,則穿越1格為1次,若按直徑方向走,10 cm為1次。垂直得分為大鼠雙前爪離開底面再落到底面為1次。分別與應(yīng)激前和應(yīng)激后,觀察5 min內(nèi)各大鼠水平運動次數(shù)和垂直運動次數(shù)。

    1.2.8取材 曠場試驗結(jié)束后,每組取12只大鼠進(jìn)行心臟灌流,至腹腔內(nèi)臟器由紅色變?yōu)樯n白色、左心房流出液為無色時改用多聚甲醛繼續(xù)灌注固定腦組織,至大鼠四肢完全變硬后停止灌流,斷頭取出腦組織,多聚甲醛固定4 h,常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋,制成 4 μm石蠟切片。每組剩余12只大鼠水合氯醛麻醉,在冰盤上快速開顱取腦,分離海馬組織,將其分為2份,一份用于ELISA測定,一份用于Western blot測定。

    1.2.9ELISA測定腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 將海馬組織在冰浴環(huán)境下研磨勻漿,15 000 r/min 離心20 min,取上清液,ELISA測定腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

    1.2.10免疫組化測定腦組織TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá) 取海馬最大的冠面切片進(jìn)行免疫組化染色:將海馬組織石蠟切片脫蠟、水化,枸櫞酸修復(fù)緩沖液高壓熱修復(fù)抗原,置于過氧化氫中孵育10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗,加入一抗:兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠MyD88多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(1∶200)過夜孵育,PBS液沖洗,加入抗兔抗體酶復(fù)合物孵育30 min,PBS液沖洗,DAB顯色10 min,流水沖洗,蘇木素復(fù)染2 min,PBS液沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗。胞漿呈棕黃色為陽性細(xì)胞。鏡下觀察200倍視野下CA1區(qū)免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)。

    1.2.11Western blot測定各組大鼠腦組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平 取大鼠海馬組織加入RIPA裂解液冰浴中勻漿,收集總蛋白,考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白總量,經(jīng)電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,加入一抗:兔抗鼠P65多克隆抗體(1∶300)、兔抗鼠p-P65多克隆抗體(1∶300)、兔抗鼠I-κBα多克隆抗體(1∶300)、兔抗鼠p-I-κBα多克隆抗體(1∶300),過夜孵育,加入二抗(1∶2 000)孵育2 h,ECL發(fā)光劑發(fā)光,膠片上曝光,經(jīng)顯影定影后,采用Quantity One軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參。目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

    2 結(jié)果

    2.13組大鼠一般狀態(tài) C組大鼠進(jìn)食、飲水、毛色、活動度均正常;M組大鼠進(jìn)食、飲水減少,毛色差、活動量明顯減少,無明顯逃避反應(yīng);CR組大鼠進(jìn)食、飲水、毛色、活動度及逃避反應(yīng)均較M組改善。整個實驗過程中共死亡15只大鼠,均另取正常大鼠按照同樣方法處理以補充。

    2.23組大鼠體重比較 應(yīng)激前,3組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.074,P=0.929);應(yīng)激后,3組大鼠體重差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.672,P<0.001),M組大鼠體重低于C組,CR組大鼠體重高于M組。見圖1。

    2.33組大鼠SP比較 應(yīng)激前,3組大鼠SP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.130,P=0.878);應(yīng)激后,3組大鼠SP差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=214.307,P<0.001),M組大鼠SP低于C組,CR組大鼠SP高于M組。見圖2。

    2.43組大鼠水平運動次數(shù)比較 應(yīng)激前,3組大鼠水平運動次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.049,P=0.952); 應(yīng)激后,3組大鼠水平運動次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=115.912,P<0.001),M組大鼠水平運動次數(shù)低于C組,CR組大鼠水平運動次數(shù)高于M組。見圖3。

    圖1 3組大鼠應(yīng)激前后體重比較Fig.1 Comparison of body weight before and after stress in three groups of ratsNote:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    2.53組大鼠垂直運動次數(shù)比較 應(yīng)激前,3組大鼠垂直運動次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.355,P=0.702);應(yīng)激后,3組大鼠垂直運動次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.910,P<0.001),M組大鼠垂直運動次數(shù)低于C組,CR組大鼠垂直運動次數(shù)高于M組。見圖4。

    2.63組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 應(yīng)激后,3組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于C組,CR組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于M組。見表1。

    2.7各組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB免疫組化表達(dá) 應(yīng)激后,3組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)高于C組,CR組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)低于M組。見表2、圖5~7。

    圖2 3組大鼠應(yīng)激前后SP比較Fig.2 Comparison of SP before and after stress in three groups of ratsNote:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    圖3 3組大鼠應(yīng)激前后水平運動次數(shù)比較 Fig.3 Comparison of horizontal exercises number before and after stress in three groups of ratsNote:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    圖4 3組大鼠應(yīng)激前后垂直運動次數(shù)比較(次/5 min)Fig.4 Comparison of vertical movements number before and after stress in three groups of rats(number/5 min)Note:Compared with C group,*.P<0.05;compared with M group,#.P<0.05.

    圖5 免疫組化測定3組大鼠海馬組織TLR4表達(dá)(×200)Fig.5 TLR4 expression in hippocampus tissue of three groups of rats by immunohistochemistry(×200)

    圖6 免疫組化測定3組大鼠海馬組織MyD88表達(dá)(×200)Fig.6 MyD88 expression in hippocampus tissue of three groups of rats by immunohistochemistry(× 200)

    圖7 免疫組化測定3組大鼠海馬組織NF-κB表達(dá)(×200)Fig.7 NF-κB expression in hippocampus tissue of three groups of rats by immunohistochemistry(×200)

    表1 3組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

    表2 3組大鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較

    表3 3組大鼠海馬組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平比較

    圖8 Western blot測定各組大鼠海馬組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平Fig.8 Western blot determination of P65,p-P65,I-κBα,and p-I-κBα protein levels in hippocampus tissue of rats in each group

    2.83組大鼠海馬組織P65、p-P65、I-κBα、p-I-κBα蛋白水平比較 3組大鼠海馬組織P65、I-κBα蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);3組大鼠海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M組大鼠海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平高于C組,CR組大鼠海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平低于M組。見表3、圖8。

    3 討論

    腦卒中后抑郁為腦卒中后比較嚴(yán)重的一類并發(fā)癥,大約1/3的腦卒中患者會出現(xiàn)腦卒中后抑郁。腦卒中后抑郁為一類慢性疾病,患者往往出現(xiàn)失望、悲觀、對治療失去信心、絕食及自殺傾向,從而對患者的預(yù)后帶來不良影響。腦卒中后抑郁的發(fā)病機制復(fù)雜,近年來研究已證實腦卒中后抑郁患者抑郁行為的發(fā)生是由促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的,腦卒中可引起IL-1β、IL-6、TNF-α等多種促炎因子水平升高,這些炎癥因子和內(nèi)分泌功能、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、突觸可塑性等病理生理過程關(guān)系密切[6-8]。下丘腦-垂體-腎上腺軸異常和抑郁癥的發(fā)生關(guān)系密切,下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活是抵御應(yīng)激的內(nèi)分泌機制之一;IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子是引起下丘腦-垂體-腎上腺素軸改變的潛在因素之一,其可引起皮質(zhì)醇和乙酰膽堿水平升高,影響去甲腎上腺素活性。炎癥細(xì)胞因子水平升高還可引起吲哚胺-2,3-雙加氧酶升高,導(dǎo)致腦組織5-HT含量下降,從而誘發(fā)抑郁癥狀的發(fā)生。如WEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)腦卒中誘發(fā)的炎癥反應(yīng)與腦卒中后抑郁的關(guān)系密切;JIAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)IL-6與腦卒中后抑郁的患病風(fēng)險呈正相關(guān),可以預(yù)測腦卒中后抑郁的預(yù)后;WIUM-ANDERSEN等[11]研究發(fā)現(xiàn)抗炎治療可降低腦卒中后抑郁的患病風(fēng)險。由此可見,抑制炎癥反應(yīng)對腦卒中后抑郁具有防治作用。

    炎癥反應(yīng)可由多種信號通路介導(dǎo),TLR4/MyD88/NF-κB信號通路為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要信號通路之一。TLRs為Ⅰ型跨膜蛋白,其和配體結(jié)合可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)同源區(qū)募集接頭蛋白,從而活化炎癥反應(yīng),產(chǎn)生一系列炎癥因子[12-16]。TLR4為研究最廣泛的一種,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,TLR4主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。腦損傷時產(chǎn)生的內(nèi)源性配體可激活TLR4,活化的TLR4通過MyD88依賴性信號通路激活NF-κB。在MyD88依賴性信號途徑中,MyD88與IL-1受體相關(guān)激酶結(jié)合,激活TNF受體相關(guān)因子-6,使I-κKɑ/β磷酸化被激活,從而進(jìn)一步激活NF-κB,NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等一系列炎癥因子,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。

    西紅花苷來源于番紅花、梔子花,具有抗腫瘤、抗血栓、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)神經(jīng)元、抗神經(jīng)炎癥等多種作用。大量研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷在多種炎癥相關(guān)性疾病中發(fā)揮抗炎作用,如LI等[12]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng);YARIJANI等[13]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對缺血再灌注引起腎臟損傷的保護(hù)作用;SHAFAHI等[14]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷通過抗炎作用抑制海馬神經(jīng)元凋亡;LIU等[15]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷對大鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有抗炎和抗關(guān)節(jié)炎作用。西紅花苷可通過NF-κB信號通路發(fā)揮作用,如FU等[18]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷通過抑制NF-κB信號通路激活來抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收;DU等[19]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷可通過抑制NF-κB信號激活減少煙曲霉誘導(dǎo)的氣道炎癥;LI等[20]研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷可抑制NF-κB信號通路引起的炎癥反應(yīng),發(fā)揮對足細(xì)胞的保護(hù)作用。

    本文通過建立腦卒中后抑郁大鼠模型,并給予西紅花苷治療,發(fā)現(xiàn)西紅花苷可改善腦卒中后抑郁大鼠的抑郁癥狀,降低海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平。表明西紅花苷可能通過抑制腦組織炎癥反應(yīng)緩解腦卒中后抑郁大鼠的抑郁癥狀。介于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,西紅花苷可通過NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng),因此推測西紅花苷可能通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮抗抑郁作用。本文對其進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)西紅花苷可降低腦卒中后抑郁大鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá),降低海馬組織p-P65、p-I-κBα蛋白水平。p-P65為NF-κB的活化形式,p-P65水平降低表明NF-κB的活化被抑制;I-κBα本身具有抑制NF-κB活化的作用,I-κBα降解可導(dǎo)致NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)活化,啟動下游因子表達(dá),抑制I-κBα降解,可抑制I-κBα磷酸化過程,降低p-I-κBα水平,從而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活化水平[21]。故本研究結(jié)果表明西紅花苷具有抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活的作用,由此推測西紅花苷可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活抑制腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而發(fā)揮對腦卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀的改善作用。

    綜上所述,西紅花苷具有抑制腦卒中后抑郁大鼠抑郁癥狀的作用,其機制可能為西紅花苷通過抑制腦組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng),從而抑制抑郁癥狀的發(fā)生。

    猜你喜歡
    海馬水平
    海馬
    張水平作品
    作家葛水平
    火花(2019年12期)2019-12-26 01:00:28
    海馬
    加強上下聯(lián)動 提升人大履職水平
    “海馬”自述
    老虎獻(xiàn)臀
    小海馬和海馬爸爸
    大灰狼(2015年6期)2015-07-16 21:01:00
    海馬
    做到三到位 提升新水平
    中國火炬(2010年8期)2010-07-25 11:34:30
    精品第一国产精品| 激情视频va一区二区三区| 亚洲五月色婷婷综合| 18禁观看日本| 精品乱码久久久久久99久播| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲成人手机| 成年av动漫网址| 久久久欧美国产精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 少妇人妻久久综合中文| 精品高清国产在线一区| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日本中文国产一区发布| 久久香蕉激情| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩 亚洲 欧美在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久欧美国产精品| cao死你这个sao货| √禁漫天堂资源中文www| 无限看片的www在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久免费观看电影| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品国产av成人精品| 91字幕亚洲| 亚洲久久久国产精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 桃红色精品国产亚洲av| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品成人在线| 黄色片一级片一级黄色片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜成年电影在线免费观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 人妻 亚洲 视频| 国产精品九九99| 精品视频人人做人人爽| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 国产av一区二区精品久久| 欧美午夜高清在线| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产视频一区二区在线看| 人妻 亚洲 视频| av网站免费在线观看视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一本久久精品| 日韩视频在线欧美| 欧美xxⅹ黑人| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 久久久久精品人妻al黑| 日本一区二区免费在线视频| 国产1区2区3区精品| 国产一级毛片在线| www.999成人在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 女人精品久久久久毛片| 成人影院久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| www日本在线高清视频| av免费在线观看网站| 性色av一级| 久久久久久久国产电影| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 永久免费av网站大全| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线av久久热| 久久青草综合色| 一区二区三区乱码不卡18| 97人妻天天添夜夜摸| 蜜桃国产av成人99| 精品一品国产午夜福利视频| 满18在线观看网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美大码av| 动漫黄色视频在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 一级片'在线观看视频| 欧美日韩av久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 精品一品国产午夜福利视频| 中文欧美无线码| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费高清在线观看日韩| 久久久久国产一级毛片高清牌| 免费人妻精品一区二区三区视频| 黄片播放在线免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲七黄色美女视频| 两人在一起打扑克的视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲av成人一区二区三| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 啦啦啦免费观看视频1| 岛国毛片在线播放| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 人人妻人人澡人人看| 久久ye,这里只有精品| 一本大道久久a久久精品| 丝袜在线中文字幕| 热99久久久久精品小说推荐| 最黄视频免费看| 中文字幕高清在线视频| 久热这里只有精品99| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日本a在线网址| 久久久国产一区二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 777米奇影视久久| 手机成人av网站| 久久久欧美国产精品| 成人黄色视频免费在线看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一进一出抽搐动态| 欧美乱码精品一区二区三区| 999久久久国产精品视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 女人精品久久久久毛片| 99国产精品99久久久久| 妹子高潮喷水视频| 在线永久观看黄色视频| 免费观看人在逋| 在线观看免费日韩欧美大片| www.精华液| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品1区2区在线观看. | 黑丝袜美女国产一区| 国产淫语在线视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 脱女人内裤的视频| 91大片在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧洲日产国产| 午夜福利影视在线免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本黄色日本黄色录像| 国产色视频综合| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日韩亚洲高清精品| 在线看a的网站| 欧美精品av麻豆av| 男女午夜视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 91大片在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 99精国产麻豆久久婷婷| 青春草亚洲视频在线观看| 飞空精品影院首页| 国产伦人伦偷精品视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 超色免费av| 午夜福利视频精品| 考比视频在线观看| 亚洲av男天堂| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲av电影在线进入| 午夜激情久久久久久久| 日韩一区二区三区影片| 国产三级黄色录像| 免费观看a级毛片全部| 国产亚洲欧美精品永久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 不卡av一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 日韩视频一区二区在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| av线在线观看网站| 国产成人影院久久av| 真人做人爱边吃奶动态| 搡老岳熟女国产| 国产精品偷伦视频观看了| 91精品伊人久久大香线蕉| 男人添女人高潮全过程视频| 久久香蕉激情| 在线 av 中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 欧美大码av| 老熟女久久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 99国产精品一区二区三区| 亚洲视频免费观看视频| 国产黄频视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产欧美网| 麻豆乱淫一区二区| 国产在线一区二区三区精| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品免费久久久久久久清纯 | 99热网站在线观看| 超碰97精品在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲国产中文字幕在线视频| 十八禁高潮呻吟视频| 1024视频免费在线观看| 在线观看免费高清a一片| 飞空精品影院首页| 十八禁网站免费在线| 日韩大码丰满熟妇| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美精品亚洲一区二区| 国产免费av片在线观看野外av| 超色免费av| 久久青草综合色| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一个人免费在线观看的高清视频 | 无限看片的www在线观看| 在线天堂中文资源库| 一区在线观看完整版| 国产精品免费大片| 热99国产精品久久久久久7| 一个人免费看片子| 性色av乱码一区二区三区2| 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品影院久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产人伦9x9x在线观看| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品一二三| 国产精品 国内视频| 777米奇影视久久| 99国产精品99久久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产伦理片在线播放av一区| 这个男人来自地球电影免费观看| 高清在线国产一区| 亚洲欧美激情在线| 高清视频免费观看一区二区| 欧美成狂野欧美在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| a级毛片黄视频| 久热这里只有精品99| av网站免费在线观看视频| 亚洲综合色网址| a级毛片黄视频| 国产真人三级小视频在线观看| 免费观看av网站的网址| 国产成人欧美在线观看 | 91av网站免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 五月天丁香电影| av在线老鸭窝| 大型av网站在线播放| 成人三级做爰电影| 国产精品一二三区在线看| 视频区欧美日本亚洲| 国产亚洲欧美精品永久| 在线观看www视频免费| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品国产乱码久久久久久小说| 久久精品国产综合久久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产免费现黄频在线看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 9191精品国产免费久久| 高清视频免费观看一区二区| 国产高清国产精品国产三级| 日本五十路高清| 久久国产精品大桥未久av| 国产成人av激情在线播放| avwww免费| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 咕卡用的链子| 男人添女人高潮全过程视频| 香蕉国产在线看| 国产1区2区3区精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| videosex国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 美女国产高潮福利片在线看| 国产成人系列免费观看| 在线观看免费视频网站a站| 99国产极品粉嫩在线观看| 中文字幕制服av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜免费观看性视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 操美女的视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产三级黄色录像| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一区福利在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 美女主播在线视频| 麻豆乱淫一区二区| 十八禁人妻一区二区| 一本大道久久a久久精品| 亚洲第一青青草原| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 咕卡用的链子| 人妻 亚洲 视频| 久久香蕉激情| 久久精品国产综合久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产伦人伦偷精品视频| 777米奇影视久久| 国产亚洲一区二区精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 丝袜脚勾引网站| 国产伦人伦偷精品视频| 超碰成人久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧美一区二区三区久久| 视频区欧美日本亚洲| 国产99久久九九免费精品| 国产伦理片在线播放av一区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品久久久av美女十八| 777米奇影视久久| 波多野结衣av一区二区av| 极品人妻少妇av视频| 成人av一区二区三区在线看 | 搡老熟女国产l中国老女人| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲久久久国产精品| 国产一区二区 视频在线| 欧美午夜高清在线| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲av美国av| 我的亚洲天堂| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久青草综合色| 男女床上黄色一级片免费看| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 免费看十八禁软件| 亚洲精品第二区| 伊人亚洲综合成人网| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 欧美乱码精品一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 在线观看免费高清a一片| 国产精品九九99| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产欧美亚洲国产| 热re99久久国产66热| 国产精品九九99| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久水蜜桃国产精品网| 免费在线观看日本一区| 美女高潮到喷水免费观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩三级视频一区二区三区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩三级视频一区二区三区| 丝袜美足系列| 精品国产乱码久久久久久男人| 搡老熟女国产l中国老女人| 99国产综合亚洲精品| 美国免费a级毛片| 久久中文字幕一级| www日本在线高清视频| 在线看a的网站| a级毛片黄视频| 美女大奶头黄色视频| 一级a爱视频在线免费观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美精品亚洲一区二区| 黄片大片在线免费观看| 少妇粗大呻吟视频| 精品久久久久久电影网| 日韩一区二区三区影片| 日本av免费视频播放| 丝袜在线中文字幕| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 美女午夜性视频免费| 婷婷丁香在线五月| 人妻 亚洲 视频| 国产人伦9x9x在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久久久久精品精品| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人av激情在线播放| 青春草视频在线免费观看| 午夜老司机福利片| 手机成人av网站| 五月开心婷婷网| 男女国产视频网站| 男人添女人高潮全过程视频| 女人精品久久久久毛片| 999久久久国产精品视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品久久久久成人av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久久国内视频| 手机成人av网站| 久久中文字幕一级| 亚洲中文日韩欧美视频| 99re6热这里在线精品视频| 欧美中文综合在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 三级毛片av免费| 久久久久网色| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产成人精品久久二区二区91| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 老司机福利观看| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲国产欧美在线一区| 在线永久观看黄色视频| 精品少妇久久久久久888优播| 91成年电影在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| kizo精华| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 大码成人一级视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 伊人亚洲综合成人网| 91九色精品人成在线观看| 在线天堂中文资源库| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美在线黄色| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 成年人免费黄色播放视频| 高清在线国产一区| 啦啦啦免费观看视频1| 极品人妻少妇av视频| 少妇粗大呻吟视频| 操出白浆在线播放| 日本欧美视频一区| 91大片在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 中国美女看黄片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人免费观看mmmm| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美日韩精品网址| 波多野结衣一区麻豆| 极品少妇高潮喷水抽搐| av一本久久久久| 在线天堂中文资源库| 高清欧美精品videossex| 1024视频免费在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久视频综合| 宅男免费午夜| 热re99久久国产66热| 永久免费av网站大全| 妹子高潮喷水视频| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲视频免费观看视频| 色播在线永久视频| 久久免费观看电影| 久久久久久人人人人人| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲av美国av| 日韩免费高清中文字幕av| 中亚洲国语对白在线视频| 成人av一区二区三区在线看 | 国产伦理片在线播放av一区| 午夜91福利影院| 亚洲黑人精品在线| 老司机靠b影院| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲,欧美精品.| 精品卡一卡二卡四卡免费| 交换朋友夫妻互换小说| 丝袜在线中文字幕| 各种免费的搞黄视频| 欧美黑人精品巨大| www.熟女人妻精品国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 老司机福利观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产麻豆69| 自线自在国产av| 人人妻人人澡人人看| 丝袜在线中文字幕| 一区在线观看完整版| 亚洲五月色婷婷综合| 美女大奶头黄色视频| 老司机在亚洲福利影院| 大型av网站在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产成人精品久久二区二区91| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最近最新中文字幕大全免费视频| 老司机在亚洲福利影院| 一进一出抽搐动态| 一区福利在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 美女视频免费永久观看网站| 91麻豆av在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久网色| 操出白浆在线播放| 欧美黑人精品巨大| 热re99久久国产66热| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美中文综合在线视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久国产精品影院| 国产成人av教育| 日韩欧美一区视频在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产男女内射视频| 亚洲中文av在线| 午夜激情av网站| 国产极品粉嫩免费观看在线| 午夜免费观看性视频| 精品高清国产在线一区| 中亚洲国语对白在线视频| 乱人伦中国视频| 搡老乐熟女国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 激情视频va一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 99re6热这里在线精品视频| 丝袜脚勾引网站| 99热国产这里只有精品6| 午夜福利乱码中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 十八禁人妻一区二区| 丝袜喷水一区| xxxhd国产人妻xxx| 99国产精品一区二区蜜桃av | 麻豆乱淫一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| bbb黄色大片| 亚洲视频免费观看视频| 无限看片的www在线观看| 亚洲天堂av无毛| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 在线观看免费高清a一片| 又大又爽又粗| 欧美精品高潮呻吟av久久| 一级毛片女人18水好多| 母亲3免费完整高清在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品av久久久久免费| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲专区国产一区二区| 日韩大片免费观看网站| 亚洲国产日韩一区二区| 久热爱精品视频在线9| 欧美黄色淫秽网站| 成年人免费黄色播放视频| 一级a爱视频在线免费观看| 国产区一区二久久| 久久久久精品人妻al黑| av免费在线观看网站| av片东京热男人的天堂| 99精品欧美一区二区三区四区| 在线 av 中文字幕| 一区二区av电影网| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黑人操中国人逼视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲第一av免费看| 真人做人爱边吃奶动态| 免费人妻精品一区二区三区视频| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲国产欧美网| 后天国语完整版免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 后天国语完整版免费观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频|