花姜酮通過調(diào)節(jié)E6/E7蛋白表達(dá)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞①

王慧玲 劉珊珊 楊 君 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，衛(wèi)輝 453100)

宮頸癌常與人類乳頭瘤病毒(human papilloma-virus，HPV)感染有關(guān)[1]。常見致癌的HPVs，如HPV-16和HPV-18，可引發(fā)宮頸癌。HPV病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒蛋白E6/E7的表達(dá)促進(jìn)宮頸的癌變和惡性生長[2]。E6和E7 HPV癌蛋白的表達(dá)是其致癌性的關(guān)鍵因素，也可能影響其毒性，包括轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化。病毒E6和E7基因的表達(dá)對HPV的轉(zhuǎn)化活性至關(guān)重要[3]。病毒E6和E7癌蛋白維持著HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的成瘤表型[4]?；ń?zerumbone，ZER)是一種在亞熱帶生姜中發(fā)現(xiàn)的一種單萜烯，對包括宮頸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和結(jié)腸癌在內(nèi)的幾種腫瘤細(xì)胞系具有抑制作用[5-9]。然而，尚未有研究闡明ZER與E6和E7癌蛋白是否存在調(diào)控關(guān)系。本文旨在研究ZER對宮頸癌的作用及其可能的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、C4-1、SiHa 和 Caski購自美國ATCC； DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 g/ml)購自美國Gibco公司，生化標(biāo)準(zhǔn)品ZER(純度≥98% HPLC)、二甲基亞砜(DMSO)、coaktail、苯甲磺酰氟(PMSF)、Hoechst 33342染料購自Sigma-Aldrich公司；聚偏二氧乙烯膜(polyvinyvidene fluoride，PVDF)膜購自美國Millipore公司；抗體：兔抗人anti-Vimentin、anti-GAPDH、anti-Ki67、anti-caspase-3、anti-VEGF、anti-MMP14、anti-Ecadherin、anti-Twist1、anti-zeb1、anti-N-cadherin單抗購自美國Abcam公司；anti-Snail1單抗購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)山羊抗兔二抗多抗購自美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司； chemdoc xRS成像系統(tǒng)和Quantity One分析軟件購自美國Bio-Rad Laboratories公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek Instruments公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只7周齡雌性BALB/c無胸腺裸鼠，體重150～180 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0012。小鼠處于housedin氣候控制條件下，并可以自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境是12 h的明/暗循環(huán)，恒溫為(22±1)℃，濕度為55%±5%。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和異位異種移植瘤模型建立 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 g/ml)的DMEM培養(yǎng)基中，每隔2 d換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)HeLa細(xì)胞幾乎長滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底部時(shí)，用胰酶消化傳代或收集細(xì)胞。使用雌性BALB/c無胸腺的裸鼠進(jìn)行造模。將1×106個(gè)HeLa細(xì)胞(100 μl)通過皮下注射植入BALB/c裸鼠，7 d內(nèi)出現(xiàn)異種移植瘤代表模型建立成功。為檢測ZER對異種移植瘤的影響，將裸鼠分為對照組和處理組，每組8只，參考ABDUL等[10]的研究方法，將對照組和處理組裸鼠分別予以等體積生理鹽水和16 mg/kg ZER進(jìn)行腹腔注射，3 d/次，持續(xù)32 d，于最后1 d測量腫瘤體積后，處死動(dòng)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8測定細(xì)胞活力 本研究采用CCK-8法檢測ZER的細(xì)胞毒性以及HeLa細(xì)胞的增殖情況。毒性試驗(yàn)：用不同濃度ZER(0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L) 處理HeLa 細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值。為了檢測ZER對HeLa 細(xì)胞增殖的影響，處理組和對照組HeLa 細(xì)胞分別用2.5 μmol/L ZER和未加ZER的培養(yǎng)基處理，分別于0 h、24 h、48 h、96 h時(shí)收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞懸液490 nm處吸光度值。

1.2.3Hoechst 33342染色 收集HeLa細(xì)胞并重懸于含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)基中，密度1×106個(gè)/ml。根據(jù)制造商說明書用Hoechst 33342染色溶液37℃下孵育HeLa細(xì)胞60 min。最后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域，計(jì)算濃縮細(xì)胞核細(xì)胞數(shù)(出現(xiàn)藍(lán)色光亮熒光)，測定凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

1.2.4Western blot分析 HeLa 細(xì)胞分別用2.5 μmol/L ZER和對照溶液處理48 h，收集兩組細(xì)胞；收集2組小鼠腫瘤并勻漿腫瘤組織。采用添加coaktail和PMSF的RIPA裂解緩沖液提取蛋白。蛋白質(zhì)(40 μg)上樣到SDS-PAGE(6%～12%)中電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。脫脂牛奶封閉2 h后，經(jīng)過1∶1 000工作濃度的兔抗人一抗單抗孵育過夜，之后再經(jīng)過1∶5 000工作濃度的山羊抗兔二抗多抗繼續(xù)孵育2 h，去離子水漂洗后采用HRP-ECL發(fā)光法進(jìn)行曝光顯影，采用Image J軟件通過蛋白條帶灰度值分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5Transwell法檢測ZER對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響 將HeLa (5×104個(gè)/200 μl)細(xì)胞接種在含無血清DMEM的Transwell小室上室中，下室加入500 μl含10%FBS的DMEM新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)，上室和下室均加入2.5 μmol/L ZER。培養(yǎng)24 h后，用95%乙醇固定下室細(xì)胞并用蘇木精染色，統(tǒng)計(jì)下室細(xì)胞數(shù)目，即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6免疫組化 取2組小鼠腫瘤組織進(jìn)行固定石蠟包埋，制成切片保存。切片經(jīng)過脫蠟復(fù)水處理，首先用3%過氧化氫在37℃下處理10 min進(jìn)行脫色處理。然后，用10%羊血清在37℃封閉30 min。隨后，在4℃冰箱孵育抗caspase-3和抗Ki67抗體12 h。次日，用PBS漂洗3次，每次10 min，接著在室溫下孵育二抗30 min，然后加入顯色試劑3，30-二氨基苯胺，用光學(xué)顯微鏡觀察陽性棕色細(xì)胞并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)組間分析采用TWO-WAY ANOVA；列分析采用ONE-WAY ANOVA和t檢驗(yàn)。以P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1E6/E7蛋白在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá) 如圖1所示，E6/E7在正常宮頸癌上皮細(xì)胞Ect1/E6E7中呈低表達(dá)；與Ect1/E6E7相比，E6/E7在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、C4-1、SiHa 和 Caski中表達(dá)明顯上升(P<0.01)。

2.2ZER抑制宮頸癌細(xì)胞活力 如圖2 所示，ZER以濃度依賴的方式抑制宮頸癌細(xì)胞活力。5 μmol/L ZER處理時(shí)，細(xì)胞活力為80%。而大于該濃度表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性，因此本研究采用最大抑制效果而無明顯細(xì)胞的毒性的5 μmol/L作為后續(xù)ZER處理細(xì)胞的濃度，且選擇HeLa細(xì)胞作為宮頸癌細(xì)胞的代表。

2.3ZER抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖 如圖3A所示，與對照組相比，ZER明顯抑制HeLa細(xì)胞增殖(P<0.01)；ZER顯著下調(diào)增殖標(biāo)記蛋白Ki67和PCNA的表達(dá)(P<0.01，圖3B)，驗(yàn)證了ZER對HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用。

2.4ZER促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡 如圖4A所示，ZER明顯增加HeLa細(xì)胞凋亡比例(P<0.01)，ZER顯著上調(diào)凋亡標(biāo)記蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)(P<0.01,圖4B)，驗(yàn)證了ZER對HeLa細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

2.5ZER抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲 如圖5A所示，ZER明顯減少HeLa細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.01)，ZER顯著下調(diào)轉(zhuǎn)移標(biāo)記蛋白MMP-14的表達(dá)(P<0.01，圖5B)，驗(yàn)證了ZER對HeLa細(xì)胞侵襲的抑制作用。

圖1 Western blot檢測E6/E7蛋白表達(dá)水平Fig.1 Western blot for detecting protein expressions of E6/E7Note:Compared with Ect1/E6E7,**.P<0.01.

圖2 CCK-8檢測ZER對宮頸癌細(xì)胞活力的影響Fig.2 CCK-8 for detecting effect of ZER on cell viability of cervical cancer cells

圖3 ZER抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖Fig.3 ZER inhibited cell proliferation of HeLa cellNote:Compared with control,**.P<0.01.

圖4 ZER促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡

圖5 ZER抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲

圖6 ZER抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞EMT和E6/E7表達(dá)Fig.6 ZER inhibited protein expressions of EMT and E6/E7 pathways in HeLa cellNote:Compared with control,**.P<0.01.

圖7 ZER抑制小鼠宮頸癌生長Fig.7 ZER inhibited cervical cancer tumor growth in miceNote:Compared with control,**.P<0.01.

圖8 ZER下調(diào)HeLa移植瘤中Ki67蛋白表達(dá)，上調(diào)caspase-3表達(dá)Fig.8 ZER downregulated protein expressions of Ki67 and upregulated protein expressions of caspase-3 in HeLa xenograftNote:Compared with control,**.P<0.01;scale bar=100 μm.

2.6ZER抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞EMT和E6/E7表達(dá) 如圖6所示，ZER明顯下調(diào)促EMT的蛋白如Vimentin、Snail、和N-cadherin表達(dá)，上調(diào)逆轉(zhuǎn)EMT的蛋白E-cadherin表達(dá)(P<0.01)；同時(shí)，ZER明顯下調(diào)E6/E7表達(dá)(P<0.01)。

2.7ZER體內(nèi)抑制小鼠宮頸癌生長 如圖7A所示，處理組腫瘤體積明顯小于對照組(P<0.01)；ZER處理后腫瘤質(zhì)量也比對照組低(P<0.01)。

2.8ZER下調(diào)HeLa移植瘤中Ki67蛋白表達(dá)，上調(diào)caspase-3表達(dá) 如圖8所示，處理組腫瘤組織Ki67蛋白表達(dá)明顯被ZER抑制(P<0.01)，而caspase-3表達(dá)明顯被ZER誘導(dǎo)(P<0.01)。

3 討論

宮頸癌是由HPV感染引起的。大多數(shù)HPV感染是無害和自發(fā)清除的，但持續(xù)的高危HPV感染(特別是16型和18型)可導(dǎo)致宮頸癌[1，11-12]。E6/E7蛋白是篩查和診斷中國人群宮頸癌前病變和宮頸癌的潛在標(biāo)志物[13]。研究表明，E6可誘導(dǎo)抑癌蛋白p53的降解，而E7則干擾視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑癌蛋白的活性[14-15]。抑制HPV陽性癌細(xì)胞中的E6/E7蛋白會(huì)導(dǎo)致抑癌途徑重新激活。例如，研究表明，抑制E6主要導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，而聯(lián)合抑制E6/E7則可使癌細(xì)胞生長抑制[16-17]。本文研究表明，在HPV-16型宮頸癌細(xì)胞SiHa 和 Caski以及HPV-18型宮頸癌細(xì)胞HeLa 和 C4-1中，E6/E7蛋白均呈高表達(dá)狀態(tài)。說明E6/E7表達(dá)與宮頸癌有直接的關(guān)系，抑制E6/E7表達(dá)可能抑制宮頸癌的發(fā)展。

ZER是1956年從Z.zerumbet rhizomes根莖揮發(fā)油中分離得到的第一個(gè)化合物[5]。ZER的抗癌作用已被廣泛研究。ZER可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。例如，ZER被報(bào)道參與抑制卵巢癌和宮頸癌細(xì)胞IL-6并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期暫停[5]；與上述文獻(xiàn)一致，本研究表明ZER可促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，抑制HeLa細(xì)胞增殖。ZER可抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。例如，ZER通過抑制IL-8和MMP-3在人三陰性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)從而抑制IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲[18]；ZER通過MAPK信號通路抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[19]；本研究中Transwell 實(shí)驗(yàn)證明ZER抑制HeLa細(xì)胞侵襲，抑制MMP-14表達(dá)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT)是一個(gè)涉及胚胎發(fā)生、組織再生和腫瘤進(jìn)展的可逆生物學(xué)過程[20]。在原發(fā)性腫瘤中，E-cadherin等上皮標(biāo)志物減少，N-cadherin、vimentin、Snail等間質(zhì)標(biāo)志物增多，可促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[21-22]。研究表明，ZER可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞EMT過程[23]。本研究表明，ZER上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin、vimentin、Snail表達(dá)，證明ZER可抑制HeLa細(xì)胞EMT過程。本研究證明ZER可抑制HeLa細(xì)胞E6/E7蛋白的表達(dá)。同時(shí)，本研究結(jié)果初步表明ZER可能通過抑制胞E6/E7蛋白的表達(dá)和EMT從而抑制HeLa細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ZER的抗腫瘤作用。

綜上所述，ZER可能通過抑制胞E6/E7蛋白的表達(dá)和EMT抑制HeLa細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制體內(nèi)腫瘤的生長。